壳聚糖石墨烯固化酶的过氧化氢传感器的研究【毕业设计+开题报告+文献综述】.doc

1、 本科 毕业设计 （ 20 届） 壳聚糖 /石墨烯固化酶的过氧化氢传感器的研究 所在学院 专业班级 化学工程与工艺 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 本文用滴加方法将 壳聚糖包裹的石墨烯与 硫堇的混合液滴涂在金电极上，干燥后将纳米金吸附固定在电极电表面，接着吸附固定 表面带正电荷的辣根过氧化物酶 （ HRP） ，制成了新型过氧化氢生物传感器。探讨了工作电位、温度、 PH对电极响应的影响，考察了电极的重现性、抗干扰能力。实验发现，该传感器具有线性范围宽、检出限低、抗干扰能力强等特点。其线性范围为 3.310-5 mol/L 1.510-3 mol/L，检出限为 1.

2、010-5moI/L，米氏常数为 0.35mmol/L，表明所固定的酶具有较高的生物活性。 关键词 : 过氧化氢；辣根过氧化物酶（ HRP）；纳米金； 壳聚糖 /石墨烯；化学修饰电极 II Abstract: Through using dropping method with graphene of chitosan wrapped and mixture coated droplets of thionine on gold electrode coated droplets, then let nano-Au adsorb and fix on the electrode surface

3、 after drying , and then adsorbing the positively charged horseradish peroxidase (HRP) on fixed surface , made a novel hydrogen peroxide biosensor. Discussing the effect of working potential, temperature, PH and studying the reproducibility and anti-interference ability of the electrode. It was foun

4、d that the sensor has a wide linear range, low detection limit, anti-interference ability and other characteristics. The linear range is 3.3 10-5 mol / L 1.5 10-3 mol / L, the detection limit is 1.0 10-5moI / L, Michaelis constant is 0.35mmol / L, show that the fixed enzyme has high biological activ

5、ity. Key words: Hydrogen peroxide; Horseradish peroxidase (HRP); Nano-Au; Chitosan / of graphene; Chemically modified electrode 目 录 摘要 .I Abstract . 错误 !未定义书签。 1 绪论 . 1 1.1 选题背景 . 1 1.2 相关研究成果 . 3 2 实验部分 . 6 2.1 分析方法 . 6 2.2 实验内容 . 6 2.2.1 实验仪器 . 6 2.2.2 实验试 剂 . 6 2.2.3 纳米金的制备 . 7 2.2.4 酶修饰电极的制备 . 7

6、 2.2.5 电化学检测 . 8 3 结果与分析 . 9 3.1 酶生物传感器对 H2O2的响应 . 9 3.2 扫速和工作电位对传感器电流的影响 . 10 3.3 pH 对传感器响应电流的影响 . 12 3.4 温度对传感器响应电流的影响 . 12 3.5 传感器的线性范围、检出限 . 14 3. 6 动力学参数的测定 . 错误 !未定义书签。 3.7 干扰实验 . 错误 !未定义书签。 4 结论 . 166 参考文献 . 17 致 谢 . 错误 !未定义书签。 9 1 1 绪论 1.1 选题背景 过氧化氢是许多酶催化的底物，而过氧化氢在电极上氧化时需较高的电位，使得生物样品分析时受到大量的

7、易氧化物质的干扰，所以提高过氧化氢测定的灵敏度，对于酶传 感器的灵敏度有重要影响。 本次论文的主要目标是本次论文的主要目标是采用壳聚糖 /石墨烯固化过氧化氢酶的修饰电极来研究过氧化氢的电化学行为，并研究影响修饰电极伏安行为的因素，建立一种新型的分析方法，同时研究影响测定的干扰因素，并将此法用于酶传感器的测定。 过氧化氢是许多酶催化的底物，在工业、生物、环境、临床诊断和食品分析等领域，过氧化氢的测定都具有重要的意义。在环境分析和临床实验中， H2O2是重要的检测对象。许多氧化酶反应产物里也有 H2O2，通过对其测定可进行多种酶反应的研究。对检测 H2O2的检测方法有化学发光法 、荧光法、光度法以

8、及电化学法。在电化学方法中又以各种 H2O2生物传感器为主。近年来。通过固定过氧化物酶或其酶的模拟酶制备 H2O2生物传感器得到广泛的研究，其中以辣根过氧化物酶(HRP)最为普遍 1。近年来的研究表明，碳纳米管 (CNT)具有明显的促进生物分子的电子传递作用2。 Qian3等制作了基于壳聚糖和 CNT固定 HRP的 H2O2传感器，该传感器由于工作电位较低 (-0.2 V)，可以避免其它物质的干扰，但是线性范围比较窄。最近报道的基于 MWNT和 Nano-Au固定血红蛋白的 H2O2传感器 4，获得 了较宽的线性范围，且其灵敏度更佳。李敏健等 5以硫堇为媒介体制备测定丙肝抗原的电流型免疫传感器

9、，效果良好。麦智彬等 6利用硫堇作为介体结合多壁碳纳米管、壳聚糖、辣根过氧化酶的混合包埋物制作 H2O2生物传感器，但线性范围较窄，灵敏度也不高。 过氧化氢酶 (catalase，简称 CT)，又称触酶，是一种高效，安全，无毒的生物催化剂，是一种含有四个铁原子的铁卟呤酶，通过其中的血红素功能基团，能够快速催化双氧水分解为水和氧气，是目前了解的抗活性氧生物活性物质之一。 过氧化氢酶的固定化研究国内外已 有 不少的报道，主要 的 固 定化材料包括无机金属化合物 (氢氧化铝、氧化铁等 )和改性生物材料等，形成的固定化产物有微胶囊化和膜化过氧化氢酶等。 Silgia7以氢氧化铝为载体固定化过氧化氢酶，

10、提高了酶对热和酸碱的稳定性；刘持标 8利用乙基纤维素作为膜材，加入一定量的明胶后，制备了较稳定的微胶囊化过氧化氢酶。从目前研究结果看，固定化有利于提高过氧化氢酶的稳定性，并提高其实际应用价值 9。 石墨烯是 2004年发现的一种新型的碳单质结构，因其具有诸多奇特的物理化学性质而广泛用于材料、物理、化学等领域。研究表明，由于石墨烯具有良好的导 电性、催化活性和较大的比表2 面积，用作电极材料时，可以加速物质的电子交换，尤其对过电位的大大降低及对部分氧化还原蛋白质的直接电子转移现象，这预示着在石墨烯制备化学修饰电极方面具有很大的应用前景。随着石墨烯制备纯化技术的发展和研究的深入，人们对石墨烯的性质

11、将会有更深刻的认识，从而拓宽石墨烯复合材料在电化学和分析化学领域的应用。蛋白质和酶等生物大分子的直接电化学将一直是石墨烯复合材料电极的研究热点与难点，这对于了解蛋白质的结构功能等具有重要意义。 石墨烯纳米薄片是一种只有一层或几层原子厚度的纯碳原子结构，其 C-C键 以 sp2结合，形成一个密集的蜂窝状晶格结构。由于它具有独特的二维碳纳米结构以及优异的物理属性，使得其在物理学、材料科学以及凝聚态物理等领域引起了人们的广泛兴趣。同时由于它们具有无毒、化学和热学性能优异、导电率大、机械强度大的特性，使得以石墨烯为基础的材料有着广泛的工业应用范围。10 石墨烯纳米薄片是一种只有一层或几层原子厚度的纯碳

12、原子结构，其 C-C键以 sp2结合，形成一个密集的蜂窝状晶格结构。由于它具有独特的二维碳纳米结构以及优异的物理属性，使得其在物理学、材料科学以及凝聚态物理等领域引起了人们的广 泛兴趣。同时由于它们具有无毒、化学和热学性能优异、导电率大、机械强度大的特性，使得以石墨烯为基础的材料有着广泛的工业应用范围。 10 石墨烯是构筑零维富勒烯、一维碳纳米管、三维体相石墨等 sp2杂化碳的基本结构单元，具有一些奇特的物理特性：石墨烯是零带隙半导体，有着独特的载流子特性，为相对论力学现象的研究提供了一条重要途径；电子在石墨烯中传输的阻力很小，在亚微米距离移动时没有散射，具有很好的电子传输性质；石墨烯也是迄今

13、为止发现的力学性能最好的材料之一，韧性好，有实验表明，它们每 100nm距离上承受的最大压力 可达 2.9N；石墨烯特有的能带结构使空穴和电子相互分离，导致了新电子传导现象的产生，如量子干涉效应、不规则量子霍尔效应等。 Novoselov等观察到石墨烯具有室温量子霍耳效应，使原有的温度范围扩大了 1O倍，表明其电学性能及载流子特征优异。 石墨烯具有奇异的电子效应 (如霍尔效应、二维 (2D)Dirac-femi 效应等 )，目前已引起了科学界的广泛兴趣，有着广泛的潜在应用领域，如复合材料、透明导电薄膜、锂离子电池、超级电容器、有机光伏电池、电子场发射器、场效应晶体管和超敏感传感器等 10。 壳

14、聚糖 (CHIT)是自然界唯一的碱性多糖，是从虾、蟹等甲壳类动物的外壳提取的一种胺基多糖，分布极其广泛，每年的产量仅次于纤维素，壳聚糖具有如下特性：生物相容性、生物可降解性、无毒性、无生理活性、亲水性、对蛋白质高度的亲和性、化学性质稳定、制备简单、耐热等。3 因此它是一种非常好的固定化酶的载体 9。 壳聚糖在生物传感器方面的应用：吸附法、共价法、交联法、溶胶 -凝胶法、电化学免疫测定法和自组装等。近几年，壳聚糖在生物传感器方面的应用成为新的发展趋势，壳聚糖作为最有潜力的自然多聚物用于基质固定，具有以下优点：生物降解性、化学 惰性、生物兼容性、非毒性、高机械强度、易成膜性、价格低廉等。生物分子固

15、定化方法包括物理法和化学法两大类。物理法主要是通过共混、表面吸附或涂层等实现对生物分子的固定；化学法则是指通过共聚、交联、表面修饰等手段固定生物分子 11。 壳聚糖结构上活泼的 -NH2和 -OH，对某些具有电化学活性的金属离子、阴离子及有机物等有很强的螯合、吸附作用，因此，壳聚糖可以直接作为修饰材料，制成壳聚糖修饰电极应用于电分析化学测定。壳聚糖是一种具有良好生物相容性的线型聚合物，分子中的 -NH2对各种蛋白质的亲合力非常高，而且，壳聚糖 具有多孔结构，能适用于大生物分子酶的固定化，有良好的导电性。采用壳聚糖制成的多孔膜和多孔微颗粒可作为酶、抗原、抗体等生物活性物质的固定化载体。壳聚糖膜因

16、其具有比表面积大、负载酶量多等特点，已被用作葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、脂肪酶等的固定化载体，制成反应器或酶电极。壳聚糖与其它固定酶载体比较，其原料易得，价格低廉，机械性能好，韧性强，能在温和的条件下固定酶，固定酶的效率高，反应活性高，这种固定酶可以长期保存，反复使用。固定化酶较游离酶的突出优点是：可以重复使用且易从被作用物中分离出来，大多数聚合物中的残 存单体易使酶失活，而壳聚糖不存在残存单体，故它作为酶载体时比许多聚合物具有更大的优越性。 12 1.2 相关研究成果 高风仙 13等人用循环伏安法将电子媒介体硫堇电聚合在铂电极上，使其表面形成均匀的带负电的聚合膜层，通过静电吸附作用固定表

17、面带正电荷的辣根过氧化物酶，接着吸附纳米金，然后再利用纳米金吸附固定一层辣根过氧化物酶，制成了新型过氧化氢生物传感器。实验发现，该传感器增加了酶的吸附量，响应快、灵敏度高、稳定性好，对 H2O2表现出良好的响应特性。检测范围为 5.210-7 2.010-3mol L， 检出限为 1.7 10-7moI L，并具有抗尿酸、抗坏血酸等干扰的特点。 许惠凤 14等人 实验发现，石墨烯壳聚糖复合膜内 Hb电催化还原过氧化氢的行为。当溶液中加入 H202后，还原峰急剧变大，氧化峰逐渐变小，是典型的电催化 H202还原的现象。进一步用安培法研究了 Hb修饰石墨烯壳聚糖复合膜电极对 H202的响应。在 -

18、0.3V下，在 6.5 10-62.310-3mol L浓度范围内，响应电流和过氧化氢浓度间存在着一定线性关系，检测限为 8.4 10-7mol4 L。结果表明石墨烯壳聚糖复合膜利于 Hb实现 直接电子传递，这说明了该复合膜具有良好的生物兼容性和快速的电子传递速率和优良的电子传递路径。该实验预示着石墨烯在生物传感平台的构建方面有着良好的应用前景。 张晓蕾 15等人利用壳聚糖（ Chitosan）的成膜性能以及碳纳米管在其中良好的分散性，在玻碳电极表面首先形成碳纳米管 /壳聚糖膜，通过膜表面丰富的氨基与纳米金的强静电吸附，在玻碳电极表面获得稳定的纳米 Au修饰层，吸附固定辣根过氧化物酶 (HRP

19、)，制得无需电子媒介的 H2O2生物传感器。循环伏安曲线显示，当加入 H2O2溶液后，阴极峰电流增大，而阳极电流相应 减少，表明通过碳纳米管 /壳聚糖 /纳米金活性界面固定在玻碳电极表面的 HRP与电极之间有良好的直接电子传导能力，对 H2O2的还原具有良好的电催化活性， H2O2的测定线性范围为 5.210-52.010-3mol L。检测下限为 5.010-5mol L，工作三周后，传感器仍能保持 76.0%的初始响应电流值。 罗晓虹 16等人用壳聚糖对多壁碳纳米管进行修饰 ， 构建了一种用于固定血红蛋白的新型复合材料 ， 并研究了血红蛋白在该碳纳米管上的电化学性质及其对过氧化氢的电催化活

20、性。扫描电镜结果表明 ， 壳聚糖修饰的多壁碳纳米 管呈单一的纳米管状 ， 并能均匀分散在玻碳电极表面。紫外光谱分析表明血红蛋白在该复合膜内能很好地保持其原有的二级结构。将该材料固定在玻碳电极上后 ， 血红蛋白能成功地实现其直接电化学。根据峰电位差随着扫描的变化 ， 计算得到血红蛋白在壳聚糖修饰的碳纳米管膜上的电荷转移系数为 0157， 表观电子转移速率常数为 7.02 s-1。同时 ，该电极对过氧化氢显示出良好的催化性能 ， 电流响应信号与 H2O2浓度在 1.0 10-6 1.5 10-3 mol/L间呈线性关系 ， 检出限为 5.0 10-7 mol/L，修饰电极显示了良好的稳定性。 欧朝

21、凤 17等人 制备了以硫堇（ TH）、纳米金（ Nano-Au）及多壁碳纳米管（ MWNT）修饰的H2O2生物传感器。探讨了工作电位、温度、 pH对电极响应的影响，考察了电极的重现性、抗干扰能力及使用寿命。该传感器具有线性范围宽、检出限低、灵敏度高、稳定性好和抗干扰能力强等特点。其线性范围为 7.010-7 4.010-3mol L;检出限为 2 310-7mol L；灵敏度为0.13A/(mol L-1cm2)；达到稳定电流所用时间 9s.米氏常数为 0.62mmol L，表明所固定的酶具有较高的生物活性 。 S.R.C.Vivekchand18等人用 3种方法制备了 EC电极材料石墨烯。方

22、法：热剥离碳氧化物，石墨 ( 15 m)与浓 HNO3、浓 H2SO4及 KCl在室温下反应 5d ，再在长石英试管中、 1050下热剥离石墨氧化物制得；方法：在氦气气氛中将纳米钻加热到 1650制得；方法：利用樟脑在镍纳米颗粒上分解，樟脑在第 1个炉子中缓慢升华至温度为 770、有微米级镍颗粒的第 2个炉子中制得。 5 D.S.Meryl19等将石墨烯氧化物片悬浮在水中，再用水合肼还原，合成了化学调整石墨烯(CMG)。 CMG由一 个原子厚的碳片组成 ,根据需要进行官能化。以 CMG为电极材料制备的 EC，在5.5mol/ L KOH和有机电解液中的比电容分别为 135 F/ g和 99 F

23、/ g，由于电极材料的高导电性 ,EC在很宽的伏安扫描速率内具有很好的性能。 CMG具有很好的导电性和很大的表面积，用于 EC的潜力很大 ,且与一般电解液系统匹配。 杨常玲 20等人以石墨为原料，采用改进的 Hummers方法 21制备氧化石墨，在水中经超声分散得到氧化石墨烯水溶胶，经硼氢化钠还原得到石墨烯聚集物。采用描电镜、原子力显微镜、激光粒度分析仪、 BET氮 气吸附仪对样品的形态、粒度分布和比表面积进行了表征。采用恒流充放电和循环伏安法研究了样品的充放电性能。结果表明，氧化石墨在水溶液中可以剥离成单片层结构，石墨烯聚集物比表面积为 358m2/g，在 10mA恒流下充放电，比电容为 1

24、38.6 F/g，充放电容量效率为 98。以 550mV/s扫描速率进行循环伏安测试，石墨烯电极表现出良好的双电层电容器性能。 沈丽 22等人采用石墨烯修饰电极测定沙丁胺醇和特布他林两种 2-受体激动剂。结果表明电极表面修饰的石墨烯对沙丁胺醇及特布他林与电极表面的电子转移起了很大的促进 作用。可能原因是石墨烯表面存在大量类似于断层的缺陷位点，提供了较多的反应活性位点，加快了沙丁胺醇及特布他林与电极表面的电子传递速率。另外，石墨烯修饰电极具有很强的抗污染能力，也有利于沙丁胺醇及特布他林的氧化。研究发现沙丁胺醇的浓度与其在石墨烯修饰电极上的氧化峰电流在 5.0 10-6 9.0 10-5mol/L

25、之间存在良好的线性关系， 而特布他林的浓度与电流在 8.0 l0-6 1.0 10-4mol/L范围内呈线性关系。二者的检出限均为 l 10-7 mol/L(信噪比为 3)。由于石墨烯修饰电极制备方法简单， 对沙丁胺醇和特步他林表现出良好的电化学响应，因此可望用于沙丁胺醇及特布他林片剂或含有以上 2-受体激动剂的生物样品、饲料等其他样品的检测。 6 2 实验部分 2.1 分析方法 本 文采用 循环伏安法 来研究过氧化氢 在修饰电极上 的电化学行为，并研究影响修饰电极伏安行为的因素，建立一种新型的分析方法，并将此法用于酶传感器的测定。 本文利用了壳聚糖 /石墨烯、硫堇、纳米金等新型材料改善电极的

26、电子传导能力，降低了过氧化氢的过电位，增大了电极的电化学响应值。 2.2 实验内容 2.2.1 实验仪器 表 2-1 实验主要仪器 仪器名称 规格 生产厂家 电化学工作站 CHI660A 上海辰华仪器公司 工作电极 金 电极 上海 CHI公司 参比电极 饱和甘汞 电极 （ SCE） 上海 CHI公司 辅助电极 Pt丝电极 上海 CHI公司 超声仪 SY1200 上海声源超声波仪器设备有限公司 制超纯水仪 Newhumanup900 Human cooperation. Ltd 电子天平 AL204 梅特勒 -托利多仪器有限公司 红外快速干燥箱 WS70-1 巩义市英峪予华仪器厂 透射电子显微镜 TECNAI10 PHILIPSFEICo.， Holland 超级数显恒温器 CS501-SP 重庆四达实验仪器厂 2.2.2 实验试剂 表 2-2 实验主要试剂 试剂名称 规格 生产厂家 草酸钠（ NaC2O4） 分析纯 浙江中星化工试剂有限公司