四环素对蓝藻的急性毒性研究.doc

1、上海应用技术学院 毕业论文 题 目： 四环素对蓝藻的急性毒性研究 专 业： 环境工程 班 级： 学生姓名： 学生学号： 指导老师： 化 学 与 环 境 工 程 学院 2013 年 5 月 30 日 上海应用技术学院毕业设计（论文）任务书 题目：四环素对蓝藻的急性毒性研究 学生姓名： 学号： 专业：环境工程 任务起止日期： 2012 年 12 月 25 日至 2013 年 5 月 30 日 共 16 周 一、 课题的任务内容： 1、了解并掌握抗生素四环素的化学性质及生物有效性。 2、了解藻类的一般实验室培养方法。 3、 掌握急性毒性实验方法。 4、化合物的染毒及抗生素残留分析。 二、原始条件及数

2、据： 1、铜绿微囊藻（ Microcystis aeruginosa） FACHB 905 购于中国科学院武汉水生所（武汉，中国）。藻细胞用 BG11（ pH=9.0）培养基培养。置于 RXZ 智能人工气候箱，温度281C，光强 40mol/m2S，湿度 60%，白天 /黑夜 =12h/12h。 2、 急性毒性实验参照 OECD 标准实验方法进行。 3、 化合物染毒基本条件具备。 4、 急性毒性实验及蛋白含量检测条件具备。 5、 抗生素液相检测方法基本建立。 三、设计的技术要求（论文的研究要求） 1、 掌握蓝藻培养方法； 2、 掌握藻类急性毒性实验方法； 3、 掌握蛋白含量测定方法； 4、 掌

3、握液相检测抗生素的方法 。 5、 掌握数据分析基本方法。 四、毕业设计（论文）应完成的具体工作 1、 实验室稳定培养蓝藻细胞； 2、 蓝藻细胞生长曲线绘制及 EC50 计算； 3、 蛋白含量检测； 4、 抗生素在藻液体系中的含量变化检测。 5、 数据分析，论文撰写。 五、查阅文献要求及主要的参考文献 1. Chorus, I.; Bartram, J., Toxic Cyanobacteria in Water: a guide to their public health consequences, monitoring and management. E Beasley, V. R.; C

4、armichael, W. W.; Kleppe, G.; Hooser, S. B.; Haschek, W. M., Blue-green algae (Microcystis aeruginosa) hepatotoxicosis in dairy cows. Am J Vet Res 1987, 48 (9), 1415-20. 3. Carmichael, W. W., Cyanobacteria secondary metabolites-The cyantoxins. J. Appl. Bacteriol. 1992, 72 (6), 445-459. 4. WHO, Guide

5、lines for drinking-water quality, 2nd ed.; addendum to Vol. 2, Health criteria and other supporting information. Geneva, Switzerland, 1998. 5. Mackintosh, C.; Klumpp, S., Tautomycin from the bacterium Streptomuces-verticillatus- another potent and specific inhibitor of protein phosphatase-1 and phos

6、phatese-2A. FEBS Lett. 1990, 277 (1-2), 137-140. 6. Matsushima, R.; Yoshizawa, S.; Watanabe, M. F.; Harada, K.; Furusawa, M.; Carmichael, W. W.; Fujiki, H., Inbitro and invivo effects of protein phosphatase inhibitors, microcystins and nodularin, on mouse skin and fibroblasts. Biochem. Biophys. Res.

7、 Commun. 1990, 171 (2),867-874. 7. Honkanan, R. E.; Codispoti, B. A.; Tse, K.; Boynton, A. L., Characterization of natural toxins with inhibitory activity against serine thereonine protein phosphatases. Toxicon 1994, 32 (3), 339-350. 8. Bogtalli, S.; Bruno, M.; Curini, R.; Corcia, A. D.; Fanali, C.;

8、 Lagana, A., Mornitoring algal toxins in lake water by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Environ. Sci. Technol. 2006, 40, 2917-2923. 9. Harada, K.-I.; Matsuura, K.; Suzuki, M.; Oka, H.; Watanabe, M. F.; Oishi, S.; Dahlem, A. M.; Beasley, V. R.; Carmichael, W. W., Analysis and purificat

9、ion of toxic peptides from cyanobacteria by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1988, 448, 275-283. 10. Meriluoto, J.; Kincaid, B.; Smyth, M. R.; Wasberg, M., Electrochemical detection of microcystins, cyanobacterial peptide hepatotoxins, following high

10、-performance liquid. 六、进度安排：（设计或论文各阶段的要求，时间安排） 1 4 周： 文献综述撰写，英文翻译。 5 14 周：实验室实验。 15 16 周： 整理数据，论文撰写。 指导老师： 审核意见： 教研室主任： 四环 素对蓝藻的急性毒性研究 摘要： 四环素类抗生素是目前使用最广泛、用量最大的抗生素种类之一 , 其在环境中的大量残留带来了潜在的环境风险。本文介绍了四环素类抗生素的污染现状以及生态毒性。并以水华蓝藻铜绿微囊藻为研究对象，通过四环素对铜绿微囊藻的生长抑制、四环素对藻液pH 值的影响、四环素对蛋白质含量的影响，研究四环素对蓝藻的急性毒性。结果表明： 1 mg

11、/L 的四环素能够刺激铜绿微囊藻细胞的生长，而铜绿微囊藻在长时间暴露于高浓度四环素时其生长明显受到抑制。本文同时通过高效液相色谱法检测了四环素在铜绿微囊藻液中的降解情况 ，结果表明：该反应属于一级动力学反应， Ln（四环素浓度）与反应时间呈线性关系。为今后的研究方向进行了探计，旨在为其生态风险评价提供有价值的参考。 关键词： 四环素、铜绿微囊藻、急性毒性、抑制、降解 Acute toxicity of tetracycline on Microcystis aeruginosa Abstract: Tetracycline antibiotics are widely used in the

12、world. This is one of the largest types of antibiotics, which can remain in the environment and bring potential environmental risks. In this study, the eco-toxicity of tetracyclines on cyanobacteria Microcystis aeruginosa was studied. Growth inhibition of this kind of algae exposure to tetracycline

13、was measured. pH values, protein content, were also studied to determine the acute toxicity of tetracycline on M. aeruginosa. The results showed that at low concentration 1 mg/L tetracycline can stimulate the growth of M. aeruginosa, and in prolonged exposure to high concentrations of tetracycline,

14、M. aeruginosa growth was suppressed. This paper also detected the degradation of tetracycline in M. aeruginosa culture medium by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the reaction is a first-order kinetics reaction, Ln (tetracycline concentration) and the reaction ti

15、me showed linear relationship. And discussed the future research directions, aimed to provide valuable reference for the ecological risk assessment of the antibiotics. KeyWords: Tetracycline; Microcystis aeruginosa; Acute toxicity; Inhibit; Degradation 目录 1. 引言（绪论） . 1 1.1 抗生素的污染现状 . 1 1.2 四环素类抗生素的污

16、染现状 . 2 1.3 四环素类抗生素的生态毒性 . 3 1.3.1 四环素类抗生素对微生物的生态毒性 . 3 1.3.2 四环素类抗生素对植物的生态毒性 . 4 1.3.3 四环素类抗生素对动物的生态毒性 . 4 1.4 四环素的理化性质和药理毒理 . 5 1.4.1 四环素的理化性质 . 5 1.4.2 四环素的药理毒理 . 5 1.5 蓝藻、铜绿微囊藻 . 6 1.5.1 蓝藻概述 . 6 1.5.2 铜绿微囊藻概述 . 6 1.5.3 藻类水华 . 6 1.6 微囊藻毒素 的污染现状 . 7 1.6.1 微囊藻毒素的污染现状 . 7 1.6.2 天然及水库水体的微囊藻毒素污染 . 7

17、1.6.3 饮用水的微囊藻毒素污染 . 8 1.7 课题研究的意义和目的 . 8 1.8 课题研究的内容 . 8 2. 实验条件及预实验 . 9 2.1 实验条件 . 9 2.1.1 实验仪器 . 9 2.1.2 实验材料 . 9 2.1.3 实验药品 . 11 2.2 预实验 . 11 2.2.1 BG11 培养液的配置 . 11 2.2.2 高压蒸气灭菌 . 12 2.2.3 铜绿微囊藻的 接种 . 12 2.2.4 铜绿微囊藻的 培养 . 12 2.3 实验方案论证 . 12 3. 实验方案与方法 . 14 3.1 四环素储备液的配置 . 14 3.2 铜绿微囊藻细胞数与吸光度的关系 .

18、 14 3.2.1 实验原理 . 14 3.2.2 实验方法 . 15 3.3 铜绿微囊藻生长曲线及抑制率 . 15 3.4 铜绿微囊藻 pH 变化规律 . 16 3.5 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 . 16 3.5.1 实验原理 . 16 3.5.2 试剂配制 . 16 3.5.3 实验方法 . 16 3.6 高效液相色谱检测四环素在铜绿微囊藻液中的降解 . 17 3.6.1 实验原理 . 17 3.6.2 实验特点 . 17 3.6.3 实验方法 . 18 4. 结果与讨论 . 20 4.1 铜绿微囊藻细胞数与吸光度的关系 . 20 4.2 生长曲线与抑制率 . 21 4.3 铜绿微囊

19、藻 pH 变化规律 . 26 4.4 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 . 27 4.5 高效液相色谱检测四环素在铜绿微囊藻液中的降解 . 29 4.5.1 标准曲线 . 29 4.5.2 降解曲线 . 32 5. 结论 . 38 四环素对蓝藻的急性毒性研究 1 1. 引言（绪论） 1.1 抗生素的污染现状 抗生素是一类生物（主要是真菌、放线菌或细菌等微生物）在其代谢过程中产生的具有杀灭或抑制他种生物（主要是微生物）作用的化学物质。除从微生物培养液提取外，有些抗生素已能通过人工 合成或半合成得到。抗生素能在不同程度上起到抗菌、杀菌和抑菌作用，其作用机理主要包括：通过抑制细菌细胞壁的形成，使细菌因

20、丧失细胞壁保护而死亡；影响胞浆膜通透性，使细菌屏障和运输物质功能受到障碍；影响蛋白质合成，使细菌生长受到抑制；影响核酸代谢，使细菌生长分裂受到抑制等等。 一般来说，抗生素包括人用和兽用两类。目前大部分医院对药物的使用仍以抗生素的处方为主，这就造成了医疗系统强加给生病病人抗生素的滥用；另有一些家庭自医的人群，随意到药店擅自购买抗生素服用。 抗生素在畜禽生产中的使用就更加令人担忧，常以高剂量 使用治疗各种疾病，以低剂量使用促进畜禽生长和增产，因此其在畜禽生产中的使用量非常大。含有抗生素的畜禽粪便的土地利用是土壤中抗生素类污染物的主要来源。据报道 , 在畜禽生产中使用的抗生素有 30%90%以母体化

21、合物形式随畜禽粪便排出，某些抗生素能以母体化合物形式排出高达 95% 1、 2 。因此对该问题更应引起重视。 北京大学临床药理研究所肖永红教授等专家调查推算，中国每年生产抗生素原料 21万吨，有 9.7 万吨抗生素用于畜牧养殖业，占年总产量的 46.1%。滥用抗生素使得抗生素以活性形式存在于污水中。超过 90%的人类 使用的抗生素以活性形式排出体外，这些抗生素接着出现在我们的饮用水中，不仅会进入人体干扰正常的菌群平衡，而且还可以通过杀灭周围环境中的有益菌来破坏生态平衡。同时，农业滥用抗生素正在导致超级病毒的传播，非传染性疾病和免疫性疾病大大增加了，人类的免疫系统正在衰退，而抗生素的滥用也是造成

22、新型疾病增加的原因之一。 多方面的资料表明，现有水处理技术对污水中含有的相当一部分抗生素没有明显的去除效果如抗癫痫药卡马西平的去除率仅为 8%，而降血脂药氯贝酸的去除率几乎为 0，全部随污水处理厂出水进入受纳水体。因此，对于含有抗生素的 医院污水或城市生活污水，无论是否经过处理，只要实施排放，均可以导致对地表水、地下水以及农田土壤环境的污染。 此外兽药抗生素在畜禽养殖业中以亚治疗剂量长期添加于动物饲料，起到刺激动物生长和促进增产的作用。目前在全球范围内几乎所有地区都采用抗生素来实现增加产量、提高经济效益的目的。然而，研究表明，抗生素药物只有 15%可被吸收利用，大约 85%未被代谢而被直接排放

23、至环境中。例如，绵羊口服的土霉素中 21%通过尿液排出体外，而四环素对蓝藻的急性毒性研究 2 对于幼牛 1775%的氯四环素未经代谢就以母体化合物的形态被排出体外。到 2010 年，全国畜禽粪 便的排放量将达 45 亿吨。如此大量的畜禽粪便排放，是构成我国抗生素面源污染的主要原因之一。抗生素在水产养殖中也被广泛使用，近年来公布的数据表明，水产养殖业使用的抗生素仅有 2030%被鱼类吸收， 7080%进入水环境中。因此，水产养殖业中抗生素的大量使用，是抗生素进入水环境的一个重要途径 3 。 1.2 四环素类抗生素的污染现状 四环素类是由链霉菌产生的一类广谱抗生素，在化学结构上都属于多环并四苯羧基

24、酰胺母核的衍生物，可分为天然品和四环素类抗生素，一般通过与核蛋白体的 30S 亚单位结合，阻止氨酰基 tRNA 同核 蛋白体结合产生药理作用，起到抑菌、杀菌作用。 20 世纪40 年代末、 50 年代初，金霉素、土霉素和四环素相继从链霉菌发酵液中分离得到，这 3种四环素类抗生素都显示了完全的交叉抗性，有着相似的、广泛的抗菌谱，对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌、支原体、立克次体和衣原体之类的微生物都有活性。 1957 年，去甲环素被发现，通过对这些抗生素进行降解研究，人们发现它们具有极为相似的化学结构，有 4个环线形相连构成主体骨架，从此“四环素”被看成一类新的抗生素。目前，四环素类抗生素中最主要种类

25、包括四环素、土霉素、金霉素等，其他半合成制取种类 主要包括甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等。 四环素类抗生素在进入人或动物体内后，由于氧化、还原、水解以及共轭接合作用，这些药物形态的改变使其理化性质和生态毒性发生变化，但研究显示，随动物体排出以后，代谢物质可能会恢复为其母体化合物 4 。 在密集型养鱼场，最终有 70%80%药物流入环境之中 5 。在密集型畜牧养殖场这种现象同样严重。有报道显示：土霉素在绵羊粪便中残留 21%，金霉素在小公牛粪便中残留 17%75% 6 。 Liguoro 等 7 以 60mgkg-1d-1 土霉素的量对 50 头农场喂养的 西门塔尔牛进行 5 d 口服实

26、验，此后对其粪肥中土霉素含量进行测定。结果表明，土霉素在粪肥中的半衰期为 30 d，在粪肥熟化 5 个月后仍然检测到土霉素的残留，含量达到 820 gk-1。 在德国农业土壤和草原土壤的 010cm 土壤表层中分别检测到含有 4 mgk-1 和 0.86 mgk-1 的四环素 8 。而在荷兰，有研究推测，如果将荷兰在饲料中添加的所有促生长剂分散在 200 万 hm2 的耕地上，那么每平方米的耕地上可能发现 130 mg 抗生素及其代谢物，与之对应的是每千克干土为 0.9 mg。实际上，四环素类抗生素的分 布不可能如此均一，因此可以预测，部分地区的局部浓度要高于平均值。即由于抗生素环境浓度预测模

27、型的不成熟，以及抗生素环境分布的变异性，局部地区的浓度真实值可能远大于预测平均值 9 。 由此可见，四环素类抗生素的污染作为一个全球性普遍存在的问题，这类物质一般均具备高生物活性和持久性，这就决定了其必然具有一定的潜在生态环境风险。尤其是随着集约化现代畜禽养殖业的迅速发展，抗生素类药物构成对环境以及对生态系统和人体健康四环素对蓝藻的急性毒性研究 3 的威胁日益暴露。虽然，人们对药物及个人防护品污染物（ PPCPs）等新型污染物造成的生态环境问题给予了 越来越多的关注，而作为 PPCPs 这一大类污染物中的四环素类药物的环境污染方面的研究还相对较少 10 13 ，尤其是其污染机理及生态毒性的研究

28、还处于研究的起始阶段。因此，对四环素类药物的生态毒理研究非常必要。 1.3 四环素类抗生素的生态毒性 1.3.1 四环素类抗生素对微生物的生态毒性 由于四环素类抗生素主要用来抑制菌类物质的生长发育，因此近年来研究者们对于四环素对细菌、真菌和微藻等的生态毒性做了广泛研究。一般情况下，四环素对原核生物（如蓝藻）的毒性高于单细胞真核生物（如微藻类），单细胞生物对抗生素的敏感 度则高于多细胞生物，这也与设计生产四环素类药物的初衷一致。例如，通过对费氏弧菌的长达 24h毒性研究表明，四环素的 EC50 值为 0.0251 mgkg-1 14 。 Ferreira 等同时研究了四环素对扁藻的和卤虫的生长抑

29、制情况，结果表明，扁藻对四环素的敏感度大约为卤虫的 70 倍，这一规律也被许多类似实验所验证 15 18 。 四环素类药物对微藻的毒性主要体现在抑制微藻蛋白质合成和叶绿体的生成最终造成对微藻生长的抑制。 Ferreira 等依据 OECD201 准则藻类生长抑制测试（ OECD， 1984）研究了四环素 对扁藻的生长抑制情况。通过 96 h 暴露，在四环素浓度大于 5.3 mgL-1 溶液中扁藻的生长抑制显著， NOEC 值为 3.6 mgL-1， LOEC 值为 5.3 mgL-1， 72 h 及 96h IC50值分别为 13.16（ 95%置信区间为： 10.2418.89 mgL-1）

30、和 11.18 mgL-1（ 95%置信区间：8.3915.84 mgL-1）。 此外，四环素类药物能够抑制铜绿微囊藻和绿藻的蛋白质合成。强力霉素对绿藻的毒性为 IC50=15.2 mgL-1 19 ，土霉素能抑制等鞭金藻叶绿素含量的生 成，并且药量越大抑制作用越强；对类胡萝卜素的生成起促进作用，药量越大则类胡萝卜素含量越多。叶绿素含量减少，则藻细胞的光合作用强度下降，即新陈代谢强度减弱，细胞的繁殖能力下降。 20 王志强运用藻类抑制试验，以光密度法确定藻细胞的生物量，研究了兽医临床 12 种常用的抗菌药对铜绿微囊藻的急性毒性。试验结果表明，大多数所测定的抗菌药对铜绿微囊藻藻都有不同程度的抑制作用，半数抑制浓度（ EC50）值处于 mg/L 水平，同时，抗菌药对藻类的急性毒性呈明显的剂量效应关系，并且铜绿微囊藻对抗菌药较为敏感 21 。