贵州苗药胡三贴质量标准的研究.DOC

1、1贵州苗药胡三贴质量标准的研究靳凤云 1，马克芹 1，胡世玺 2，高源 1，孙宜春 1,(1 贵阳中医学院，贵州贵阳 550002；2 贵州贵定胡三贴药械有限公司，贵州贵定5513003）摘要:目的: 建立胡三贴的质量标准。方法:采用薄层色谱法对方中铁筷子、延胡索和威灵仙进行鉴别；采用高效液相色谱法测定了方中君药淫羊藿中淫羊藿苷的含量。结果: 薄层色谱斑点清晰，分离效果良好，专属性强，阴性对照无干扰；淫羊藿苷在 0.19521.6592g 范围内呈现良好的线性关系（r=0.9998） ；平均加样回收率为 96.29%，RSD 为 1.05%（n=9） 。结论:本法快速、简便、重现性好、回收率高

2、，结果准确可靠，可用于胡三贴的质量控制。关键词: 胡三贴；TLC；HPLC；淫羊藿苷Quality standard for Three Patches of HushiSun yi-chun 1,Jin Feng-Yun1,Hu Shi-yu2, Wang Xuan-Ju1, Zhao Yang3(1. Gui Yang College of TCM, Gui Zhou Gui Yang 550002;2. Gui Zhou Gui Ding medicine three Hu Three Patches medical device Co., Ltd., Gui Zhou Gui Ding

3、 5513003; 3. West China School of Pharmacy Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)Abstract: Objective: To establish quality standard for Three Patches of Hushi. Method: Helleborus thibetanus, Rhizoma Corydalis, Clematis chinensis Osbeckwere identified by TLC, and the content of icariin was deter

4、mined by HPLC.Result: Helleborus thibetanus, Rhizoma Corydalis, Clematis chinensis Osbeck could be identified by TLC, icariin showed a good linearity in the range of 0.19521.6592g, and r=0.9998.The average recovery was 96.29%,and RSD was 1.05%(n=9). Conclusion: This method is accurate and can be use

5、d for the quality control of Three Patches of Hushi. Key words: Three Patches of Hushi; TLC; HPLC; Icariin胡三帖是其由苗药铁筷子、延胡索、淫羊藿、威灵仙、络石藤等药组成，具有清热解毒、败毒散痈、活血消肿等功效，是胡氏传统医药秘传的济世良方，临床上主治颈椎病、腰椎病、肩周炎、风湿性关节炎、跌打损伤等各种顽固疼贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目：黔省专合字（2008）65作者介绍：靳凤云 教授，硕士生导师，研究方向为中药质量控制与新药开发。Tel: 0851-5615344 E-mail

6、:2痛，且其疗效显著 12 。胡三帖虽然已经应用于临床，但缺乏质量标准研究，不利于胡三帖的应用与推广。为了更好地控制产品质量，保证疗效，本文应用薄层层析法对方中铁筷子、延胡索和威灵仙进行鉴别研究，选用高效液相色谱法对其君药淫羊藿所含有效成分淫羊藿苷进行含量测定。结果显示，本法准确、稳定、重现性好、回收率高，阴性试验表明制剂中其他成分对淫羊藿苷的测定无干扰，可用于本品的质量控制。1. 仪器与试药 Agilent1100 高效液相色谱仪，DAD 二极管阵列检测器，METTLER AE 240 天平（十万分之一） ，DGFY45/14-1 型高温电热鼓风干燥箱，CH-250 型超声波清洗机。色谱纯乙

7、腈（天津市科密欧化学试剂开发中心） ，分析纯甲醇（上海振兴化工厂一厂） ，超纯水，淫羊藿苷对照品（供含量测定用，批号：0737-9910） 、铁筷子对照药材（由贵阳中医学院陈德媛研究员鉴定，批号：20050607） 、延胡索乙素对照品（供含量测定用，批号：709-200307） 、齐墩果酸对照品（供含量测定用，批号：110709-200304） 。色谱条件 色谱柱：色谱柱：Shim-pack VP-ODS（150L4.6） ；流动相：乙腈-水（ 28：72 ）为流动相；检测波长为 270nm；流速： 1ml/min；柱温：25。2. 方法与结果2.1 TLC 鉴别2.1.1 胡三贴中铁筷子的特

8、征鉴别 取本品 10 片，挤出药液，量取 25ml，蒸干，残渣加醋酸乙酯 20ml，加热回流 30 分钟，放冷，滤过，滤液低温挥至约1ml，作为供试品溶液。另取铁筷子对照药材 1g，加醋酸乙酯 20ml，加热回流30 分钟，放冷，滤过，滤液低温挥至约 1ml，作为对照药材溶液。再另取缺铁筷子的阴性模拟制剂 10 片，挤出药液，量取 25ml，同供试品制备方法制成缺铁筷子阴性对照溶液。照薄层色谱法（中国药典 2005 年版一部附录B）试验，吸取上述三种溶液各 10-15l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶 G 薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯-甲醇（15：3 ：3）为展开剂，展开，取出，晾

9、干，至紫外光灯（365nm）下检视，结果见彩图 1。薄层色谱图显示，供试品3色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。 1 2 3 4 5彩图 1 胡三贴中铁筷子的 TLC 鉴别图( 紫外光灯 365nm 下检视)1、铁筷子对照药材 2、缺铁筷子阴性对照液 3、供试品（批号：20060322） 4、供试品（批号：20060512） 5、供试品（批号：20060607）2.1.2 胡三贴中威灵仙的特征鉴别 取本品 10 片，挤出药液，量取 50ml，用 10%的硫酸溶液调 PH=12，至沸水浴上水解 2 小时，用乙醚振摇提取 3 次，每次30ml，合并乙醚液，挥干

10、，残渣加甲醇 1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液,作为对照品溶液。再另取缺威灵仙的阴性模拟制剂 10 片，挤出药液，量取 50ml，同供试品制备方法制成缺威灵仙阴性对照溶液。照薄层色谱法（中国药典 2005 年版一部附录B）试验，吸取上述两种溶液各 10-15l，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:3:0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶液，在 105加热显色，置紫外光灯（365nm）下检视，结果见彩图 2。薄层色谱图显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点

11、，阴性对照无干扰。41 2 3 4 5彩图 2 胡三贴中威灵仙的 TLC 鉴别图(紫外光灯 365nm 下检视)1、齐墩果酸对照品 2、缺威灵仙阴性对照 3、供试品（批号：20060322） 4、供试品（批号：20060512） 5、供试品（批号：20060607）2.1.3 延胡索的特征鉴别 取本品 10 片，挤出药掖，量取 50ml，蒸干，残渣加水10ml 使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取 3 次，每次 10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇 1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。再另取缺延胡索的阴性模

12、拟制剂 10 片，挤出药液，量取 50ml，同供试品制备方法制成缺延胡索阴性对照溶液。照薄层色谱法（中国药典 2005 年版一部附录B）试验，吸取上述三种溶液各 10-15l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G 薄层板上，以甲苯-丙酮（9:2）为展开剂，展开，取出，晾干，至碘缸中约 3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，至紫外光灯（365nm ）下检视，结果见彩图 3。薄层色谱图显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。51 2 3 4 5彩图 3 胡三贴中延胡索的 TLC 鉴别图(紫外光灯 365nm 下检视)1、延胡索乙素对照品 2、缺延胡

13、索阴性对照 3、供试品（批号：20060322） 4、供试品（批号：20060512） 5、供试品（批号：20060607）2.2 含量测定 系方中君药淫羊藿所含有效成分淫羊藿苷的含量测定，正文选用高效液相色谱法对淫羊藿苷进行测定。本法准确、稳定、重现性好、回收率高，阴性试验表明制剂中其他成分对淫羊藿苷的测定无干扰。2.2.1 色谱条件 色谱柱： Shim-pack VP-ODS（5m ，4.6150mm ） ；流动相：乙腈-水（ 2872）为流动相；检测波长：270nm；流速： 1ml/min；柱温：253。2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加稀乙醇制成每 1ml含

14、0.0976mg 的溶液，即得。2.2.3 供试品溶液的制备 取本品 10 片，挤出药液，精密吸取 5mL，置于具塞锥形瓶中，于 80水浴上挥干，精密加入稀乙醇 25ml，称定重量，超声处理60 分钟，放冷，称重，加稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.2.4 缺淫羊藿阴性对照液 按处方量取除淫羊藿以外的其他方中药材，按工艺流程制备成缺淫羊藿的阴性样品，并且按供试品溶液制备方法操作，即得。2.2.5 系统适应性试验 分别抽取淫羊藿苷对照品溶液、供试品溶液及缺淫羊藿的阴性对照液注入液相色谱仪，记录色谱图（图 1）从图中可见，在本试验条6件下，淫羊藿苷对照品的出峰时间为 8.8 分

15、钟，淫羊藿苷峰与相近的其他成分峰分离完全（分离度大于 1.5） ，阴性样品无干扰。图 1 系统适用性试验图谱A 空白溶剂色谱图 B 对照品色谱图 C 阴性色谱图 D 供试品色谱图2.2.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液适量配成不同浓度，分别进样，于270nm 处测定淫羊藿苷的峰面积。以进样量（g ）为横坐标（X） ，以峰面积为纵坐标（Y）计算回归方程。结果：盐酸小檗碱的回归方程为 y=1117.8x-3.4534，相关系数 r=0.9998，线性范围为 0.1952g1.6592g。72.2.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液 5L，连续进样 6 次，于 270nm 处分别测定淫羊藿苷的峰

16、面积，以小檗碱峰面积计算 RSD(%)值为 1.01%，表明仪器的精密度符合定量测定要求。2.2.8 稳定性试验 精密吸取供试品溶液 5L，在同一色谱条件下，分别在0、2、4、6、8、10h 进样测定，计算盐酸小檗碱的含量及 RSD(%)值，为 1.02%，表明样品在 10h 内稳定性良好。2.2.9 重复性试验 取同一批（批号 20060322）样品 6 份，按上述方法制备供试品溶液，在同一色谱条件下分别测定，计算淫羊藿苷的含量淫羊藿苷含量及RSD(%)值，RSD 为 1.35%，表明该方法的重复性良好。2.2.10 加样回收率试验 取已知含量的样品（淫羊藿苷含量按 0.597%计）9 份，

17、分别按淫羊藿苷含量的 80%、100%、120%加入对照品溶液，每个平行 3 份，按供试品溶液制备方法制成加样回收供试品液。取 20L 进样测定，计算。结果淫羊藿苷低、中、高 3 个加入量的回收率(n=3)分别为95.82%、96.88%、96.17% ；RSD 分别为 0.80%、1.59%、0.80 %；平均回收率(n=9)为 96.29%，RSD 为 1.05%，结果见表 6。结果表明本法回收率良好。表 6 加样回收率试验结果取样量(ml) 淫羊藿苷含量 (mg) 加入标准品的量 (mg) 测定量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%)10 0.597 0.4712 1.0

18、522 96.6110 0.597 0.4712 1.0482 95.7610 0.597 0.4712 1.0450 95.0910 0.597 0.5612 1.1343 95.7110 0.597 0.5612 1.1376 96.30 96.29 1.0510 0.597 0.5612 1.1507 98.6310 0.597 0.7104 1.2864 97.0410 0.597 0.7104 1.2782 95.8910 0.597 0.7104 1.2761 95.5982.2.11 含量测定按“2.3 供试品溶液的制备”项下的制备方法分别处理 10 批样品，按并按“2.1 测定

19、法”项下条件进行含量测定。结果见表 7。根据 10 批样品测定结果，考虑各批药材含量的差异，本品每贴含淫羊藿的以淫羊藿苷（C 33H40O15）计不得少于 0.42mg。表 7 样品的含量测定（n=3）批 号 淫羊藿苷含量（mg/贴） 淫羊藿苷平均含量（mg/贴）20080501 0.58520080514 0.59220080530 0.59920080603 0.60420080611 0.61120080631 0.60720080715 0.61520080728 0.58320080814 0.61220080902 0.6030.6013 讨论3.1 采用薄层色谱法对制剂中的铁筷子

20、、延胡索和威灵仙进行了鉴别，选择的展开剂主要参照 2005 年版中国药典一部 3,试验结果表明均具有独特的显色斑点或荧光斑点，且阴性样品无干扰，说明本试验最终确定的鉴别方法具有专属性，可作为该制剂的定性控制方法。3.2 本实验比较了索氏提取法、回流提取法、超声提取法。结果表明，索氏提取法操作繁琐、费时，回流提取法提取出的成分复杂，杂质干扰多，超声提取法其杂质干扰少、操作简便，省时且提取率高，所以选择超声提取法进行提取 4。3.3 本实验曾分别以乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1 磷酸和乙腈-0.1 磷酸为洗脱系统，考察了色谱的分离情况，结果表明，以乙腈-水（28:72 ）为流动相时，淫羊藿苷色谱峰出峰时间短，分离效果最佳 5。3.4 本文建立的方法快速、简便、准确，可用于胡三贴的质量控制。9参考文献：1 邱德文，杜江主编中华本草苗药卷 M贵州：贵州科技出版社，2005：14572 全国中草药汇编编写组全国中草药汇编M北京：人民卫生出版社，1975，8863 国家药典委员会中华人民共和国药典(一部)S 北京：化学工业出版社，2005：2294 孟 舒，陈再兴，杨 丹，等HPLC 测定强精胶囊中淫羊藿苷含量J 中成药，2006，28（2）：2862875 王 波，濮存海，李 辉，等HPLC测定抑抗灵片中淫羊藿苷的含量J 中成药，2006，28（10）：15471548