酵母基因组DNA提取试剂盒离心柱型.DOC

1、 1酵母基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型）GK1091 50 PrepsGK1092 100 PrepsGK1093 20 Preps一.试剂盒组成Components GK109150 Preps GK1092100 Preps GK109320 PrepsGenClean Column2.0-ml Collection TubeLysisY bufferDigestion Solution(a)Wash Solution(b)PB SolutionExt SolutionElution Buffer(c)TE(pH8.0)Boiled RNase A Proteinase K(d)Ly

2、ticase(e)protocol505010 ml20 ml12 ml20 ml20 ml10 ml15 ml240 ul250 ul250 ul110010020 ml40 ml24 ml40 ml40 ml20 ml25 ml480 ul500 ul500 ul1202010 ml8 ml12 ml8 ml8 ml10 ml15 ml120 ul100 ul100 ul1(a) Digestion Solution 低温时可能出现沉淀，请于 55适当加温溶解后使用，不会影响实验结果。(b) 首次使用前，必须在 Wash Solution 瓶中加入 4 倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用。每

3、次使用后将瓶盖盖紧，以保持 Wash Solution 中的乙醇含量。如果发现 Wash Solution 由于运输或保管不当造成体积严重不准，请用量筒定容后再加入 4 倍体积的无水乙醇。(c)Elution Buffer 为 2.5 mM Tris-HCl, pH8.5，请 4保存。TE (pH8.0) 或者水（pH7.0 ）均可以使用，但是DNA 的洗脱效率通常要低 20%左右。(d)Proteinase K 分装冻存，不得将 Proteinase K 直接加到 Digestion Solution 中，以免酶失活。(e)请于-20分装保存 Lyticase，减少反复冻融的次数，以免酶失活

4、。二产品简介酵母细胞有一层坚硬的细胞壁，妨碍了研究人员从酵母细胞中快速有效地分离提取基因组 DNA。本试剂盒提供可以高效酶解酵母细胞壁的 Lyticase 和能够特异结合 DNA 的离心吸附柱，用于提取酵母细胞中的基因组 DNA。同时本产品对经典的 SDS 裂解液进行了改良，并使用 PB Solution 与 Ext Solution 处理细胞裂解液，再经过能高效、专一吸附 DNA 的离心柱吸附后，可最大限度去除杂质蛋白以及脂类物质。三主要用途从酵母等真菌中小规模抽提基因组 DNA。四主要特点1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好。2.不需要使用有毒

5、的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。3.快速，简捷，单个样品操作一般可在 2 小时内完成。4.多次柱漂洗确保提取酵母基因组的高纯度，OD260/OD280 典型的比值达 1.71.9，长度可达50Kb100kb，可直接用于 PCR， Southern-blot 和各种酶切反应。五需自备试剂无水乙醇2六保存方法及注意事项试剂盒于常温运输，Proteinase K 、Lyticase 以及 Boiled RNase A 请于 -20保存，其它组分室温（15-25）保存，有效期为一年。Digestion Solution 中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤。眼

6、睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。七操作步骤1. 取 1-2ml 过夜培养的酵母菌液，加入至 1.5ml 离心管中，室温 8,000rpm 离心 1 分钟，尽量吸除上清，收集菌体。2. 向菌体中加入 200ul LysisY Buffer， 加入 5ul Lyticase, 充分混匀，30温育 30min。3. 8,000rpm 离心 5min，弃上清，收集沉淀。注意：以上为 5107 酵母细胞的 Lyticase 用量，实验时应根据酵母的菌株和酵母细胞的数量的不同，对Lyticase 的浓度和温育时间进行适当调整。4. 向沉淀中加入

7、200ul TE 溶液重悬沉淀，充分混匀。5. 在 200ul TE 悬浮样品中，加入 300ul Digestion Solution，混匀；加入 4ul RNase A 混匀，55保温 10 分钟；再加入 4l Proteinase K， 55保温 1030 分钟。注意：（1）应按次序加入，不得将 Proteinase K 先加入 Digestion Solution，再加到样品中。（2）保温时间取决于样品的类型。对于细胞样品，55保温 10 分钟足以使细胞裂解，释放出基因组 DNA。降解完全的样品应是透明粘稠液体。6. 依次加入 300ul Ext 溶液和 300ul PB 溶液，充分摇

8、动混匀，12000rpm 室温离心 5 分钟，溶液将分为上下两层，上层溶液为蓝色，基因组 DNA 存在于下层溶液中，两层中间可能会有一些沉淀物。然后用 1ml Tip 头伸到下层，将下层中溶液全部转移到套放于 2ml 收集管内的 GenClean 柱中，注意尽量不要吸到上层溶液和中间层沉淀。注意：此步骤加入 Ext 和 PB 溶液后，一定要充分摇匀，否则后面离心时杂质不容易分层。7. 8,000rpm 室温离心 1 分钟。取下 GenClean 柱，弃去收集管中的废液。8. 将 GenClean 柱放回收集管中，加入 500ul Wash Solution，8,000rpm ，室温离心 1 分

9、钟。取下 GenClean柱，弃去收集管中的废液。9. 重复步骤 8 一次。10. 将 GenClean 柱放回收集管中，12,000rpm，室温离心 1 分钟，以去除残留的 Wash Solution。注意：此步骤高速空离是为了去尽残留的乙醇，请勿省略，否则可能因所纯化的核酸中残留有乙醇而影响后续的实验效果。11. 将 GenClean 柱放入新的洁净的 1.5ml 离心管中，在 GenClean 柱中央加入 50100ul Elution Buffer，室温或 37放置 2 分钟。注意：（1）为提高洗脱效率，可以将 Elution Buffer 预热到 5580。（2）如果样品中基因组 D

10、NA 含量很低，用 30ul Elution Buffer 洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。12. 12,000rpm， 室 温 离 心 1 分 钟 。 离 心 管 中 的 液 体 即 为 基 因 组 DNA。 根 据 用 途 ， 样 品 可 以 4 或 -20 保 存 。注意：重复步骤 1112，将洗脱液再次加入到吸附膜上，重新洗一次，可以提高产率 10%20%。八. DNA 浓度及纯度检测得到的基因组 DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的 DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA 应在 OD260 处有显著吸收峰，OD 260 值为 1 相当于大约 50ug/ml 双链 DNA、40ug/ml 单链 DNA。OD260/OD280 比值应为 1.7-1.9,如果洗脱时不使用本试剂盒提供的 Elution Buffer，而去使用去离子水，比值会偏低，因为 pH 值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。Product Use Limitation:This product is developed, designed and sold exclusively for research purpose and in vitro use only.