抗癫痫药物与血清白蛋白相互作用的光谱学研究[开题报告].doc

1、毕业论文 开题报告 环境工程 抗癫痫药物与血清白蛋白相互作用的光谱学研究 一、选题的背景、意义 根据流行病学调查，全世界癫痫的发病率为 0.5左右 1。我国目前约有 650万癫痫患者每年新发病例约 40万。癫痫是常见的慢性惊厥性疾病。发作时，脑部病灶发生一种异常的高频放电，并向病灶周围正常脑组织扩散，引起脑细胞广泛的兴奋，从而出现特有的惊厥症状，并伴有运动、感觉、意识、行为、植物神经等功能障碍。 血清白蛋白作为一种储存和运输蛋白，是血浆中含量最丰富的蛋白，它能和许多内源性或外源性物质结合。研究其与药物分子的相 互作用，不仅对于阐明药物的运输与代谢过程非常有意义，而且对于阐明药物机理，药物动力学

2、和药物毒性非常重要。荧光技术是研究血清白蛋白与药物相互作用的重要手段。 蛋白质是生命活动的基础物质，也是构成人体新生组织，维持人体健康的重要组成成分。 各种药物与人类的生活和健康密切相关。药物分子进人血液后随着血液循环分布于全身，必然不同程度地与血浆蛋白 (主要是血清白蛋白 )结合。所以，药物一血清白蛋白的结合直接影响药物在生物体内的分布、贮存、转运、药效、药物代谢以及毒副作用等方面的性质。研究药物分子与血清白蛋白的相互作用，建 立药物与蛋白质结合的体外模型，不仅对于揭示体内药物动力学问题、指导临床合理用药具有一定意义，而且对于进行药物分子设计、开发新药等也具有重要的指导意义 2。 二、相关研

3、究的最新成果及动态 2.1 荧光光谱法 荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段 3,4 ，它能提供包括激发光谱、发射光谱、斯托克斯位移、荧光强度、量子产率、荧光偏振和荧光寿命等参数。通过对这些参数的测定，可以推断蛋白质分子在各种环境中的构象变化、色氨酸或酪氨酸残基的微环境变化、蛋白质的变性等，从而进一步阐明蛋白质结构与 功能的关系。同时，荧光光谱法还具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便等优点，因此在研究药物小分子与蛋白质相互作用中荧光光谱占有重要地位 5,6 。 荧光光谱法是研究小分子与血清白蛋白相互作用的主要手段，也是目前研究较为活跃的方法。蛋白质中色氨酸、酪氨酸的

4、存在使其具有内源荧光，在 345nm处有最大荧光峰。随着药物的加入，人血清白蛋白 (HSA)或牛血清白蛋白 (BSA)的荧光强度有规律的降低，说明药物对 HSA或 BSA有荧光猝灭作用。根据猝灭曲线可以求得药物与 HSA(或 BSA)的结合常数，确定猝灭类型。根据荧 光光谱和吸收光谱可获得药物与 HSA(或 BSA)的结合位点数，及药物与 HSA、 BSA上色氨酸残基的距离，根据反应焓变、熵变确定它们之间的相互作用力 。另外根据发射波长的移动可以判断蛋白质构象的变化。张勇等 7利用荧光猝灭法研究了丝裂霉素与血清白蛋白以及金属离子间的相互作用，结果表明血清白蛋白与丝裂霉素的结合常数 KHsA=1

5、.64 104mol L、 KBSA=1.89 l04mol L， Fe3+、 Zn2+、 Mg2+存在使结合常数降低， Cu2+使结合常数增大。丝裂霉素与牛血清白蛋白的结合位点数为 l，丝裂霉素距色 氨酸残基距离 rHSA=4.24nm,rBSA =3.76nm。它们之间的相互作用力为疏水作用力。黄波等 8研究了阿霉素与牛血清白蛋白结合作用，结果表明阿霉素的加入使 BSA的构象发生了变化。卢继新等 9,10研究了在金属离子存在下甲氨喋呤、巯嘌呤与血清白蛋白间的相互作用，研究表明金属离子存在使药物与血清白蛋白之间的结合增强、结合位点数发生改变。文献 11副研究了氯丙嗪和氯高铁红素与牛血清白蛋白

6、的相互作用，结果表明氯高铁红素可以增强氯丙嗪对的 BSA猝灭作用，使 BSA的构象发生变化。文献 12,13则报道 了抗生素类药物与血清白蛋白结合的作用模式。近年来该法也用于中草药中有效成分与蛋白质相互作用的研究 14-17，得出一些有益的结论。杨朝霞等 18研究了川陈皮素与牛血清白蛋白相互作用，研究表明川陈皮素与牛血清白蛋白的荧光有猝灭作用且猝灭方式为静态猝灭，结合常数和结合位点在 294K时分别为 3.25 104L/mol和 1.24。川陈皮素与牛血清白蛋白之间的作用力主要为疏水力。牛血清白蛋白荧光量子产率为 0.074，川陈皮素与牛血清白蛋白的非辐射能量转移效率与结合距离分别为 0.2

7、7和 1.76nm。川陈皮素与牛血清 白蛋白结后对牛血清白蛋白的构象基本上没有影响。 2.2 红外光谱法 红外光谱是研究小分子药物与血清白蛋白相互作用的新方法，它可以从蛋白质二级结构变化的层次来探讨其结构与功能的关系。谢孟峡等 19运用蛋白质红外光谱酰氨带和酰氨带结合的方法对人血清白蛋白与 -1， 2， 3， 4， 6-五 -0-倍酰 -D-葡萄糖 (PGG)作用后二级结构的变化进行了定量分析，结果表明随着药物浓度增加， PGG和 HSA之间的相互作用主要使 HSA的二级结构发生了 a螺旋向 -转角和无规结构的转化。刘媛等 20应用衰减全反射傅里叶变换红外光 谱研究了中草药三七总皂甙对牛血清白

8、蛋白溶液构象的影响，实验表明随着三七总皂甙浓度增加，蛋白质分子结构逐渐发生了由螺旋向折叠的转化。谢孟峡等 21研究了 4、 5、 7-三羟基二氢黄酮与人血清白蛋白相互作用方式。 2.3紫外光谱法 DNA分子中的碱基具有光学活性，在 260nm波长附近有最大吸收。热和碱的作用可破坏 DNA双链螺旋结构使双链变单链， 260nm波长处吸光度增大。小分子与 DNA结合后会给这种变性带来影响，可通过观察药物小分子与 DNA作用前后， 260nm处吸光度随温度或 pH变化来判断药物与 DNA作用方式。当 药物小分子与 DNA发生嵌插结合时，由于插到 DNA双螺旋碱基中的小分子对 DNA结构起到稳定作用，

9、可使 DNA变性温度 Tm值显著上升 22,23， DNA 碱变性 pH值会相应增大，增色效应相应减小 24。文献 25用碱变性曲线研究了有机锗配合物 (Ge l32)与 DNA 的作用方式，初步判断 Ge l32以嵌插方式与 DNA发生作用。药物小分子与 DNA发生嵌插结合时也会引起吸收带的红移 (蓝移 )现象或增色减色效应。吸光度减小，吸收带红移及等吸收点的形成是小分子与 DNA发生嵌插作用的光谱标志 26。曹瑛等 27用紫 外光谱研究了吩噻嗪类药物与 DNA的作用，结果表明具有平面吩噻嗪环的三种药物盐酸氯丙嗪 (CPZ)、盐酸三氟拉嗪 (TFD)、盐酸异丙嗪 (PMZ)与 DNA作用的电

10、子光谱不同。 CPZ在 306nm处有最大吸收，在约 330nm处形成等吸收点，说明 CPZ与 DNA发生了嵌插作用，而 TFD和 PMZ却没此现象出现，说明它们与 DNA作用方式不同于 CPZ。 2.4 核磁共振法 核磁共振法可以定量确定结合位点的化学变化，直接检测和识别结合体。在研究药物 -蛋白质结合物的稳定性及影响因素，药物分子的构效关系及简化药物筛选过程中发挥着独特 作用。Sulkowaska等 28朝研究了阿糖胞苷、阿斯匹林与牛血清白蛋白的相互作用，研究表明在阿斯匹林存在下可使阿糖胞苷与牛血清白蛋白的亲和力减弱。 Chen等 29报道了人血清白蛋白、水杨酸、葡萄糖及维生素 C混合物相

11、互作用机理。 2.5 圆二色光谱 圆二色光谱是研究核酸、蛋白质构象的一种很有用的工具，根据 DNA在 260nm处的吸收可以提供有关其结构的信息。张朝红等 24研究了丁基锡化合物与牛血清白蛋白的相互作用，基于圆二色光谱的研究发现，该化合物引起 BSA的构象变化和 螺旋含量减少。 Shaikh30研究了抗炎解镇痛药尼美舒利与牛血清白蛋白的相互作用，结果表明尼美舒利可以使 BSA 的构象发生改变。文献 31报道了利胆药二甲氧羟香豆与牛血清白蛋白的相互作用机理。 国内外化学工作者在药物分子与蛋白质相互作用方面的研究已有多年的历史，包括多种西药和中药活性组分，力求建立一套完整的药物分子与蛋白质相互作用

12、的光谱数据库。 Shahper N Khan32等曾用荧光光谱研究盐酸米托蒽醌与人血清白蛋白相互作用，探讨了猝灭机理并结合理论计算得到了结合常数、结合位点数、药物与色氨酸残基间的距离以及作用力类型。总之 ，对于药物小分子与血清白蛋白复杂体系的研究，仅仅用单一方法是远不能令人满意的，必须综合运用各种方法和手段进行全方位的研究才能得到比较可靠的结论。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 研究抗癫痫药物与血清白蛋白在缓冲溶液中的相互作用，方法采用荧光光谱法和紫外光谱法。结果用荧光猝灭双倒数图计算出在不同条件下二者的结合常数和结合位点数；根据福斯特非辐射能量转移理论

13、，求出 37摄氏度时抗癫痫药物与血清白蛋白之间能量转移的效率和结合距离；根据热力学参数确定抗癫痫药物与血清白蛋白之间 的作用力类型。 分别准确移取 1.0ml 1.0 10-5mol/l的 血清白蛋白 溶液于 10ml比色管中，加入 2.O ml Tris HCI缓冲溶液，再加入一定量的 药物 ，稀释至刻度。 测量药物与血清白蛋白相互作用前后的荧光强度。 荧光发射与激发狭缝宽度均为 5nm，分别扫描激发光谱和荧光光谱，并于最大激发波长和最大发射波长处测量结合产物的荧光强度和试剂空白的荧光强度 ， 此外在紫外可见分光光度计上扫描吸收光谱。 预期达到的目标：抗癫痫药物与血清白蛋白之间有较强的相互作

14、用，以疏水作用为主，抗癫痫药物对血清白蛋白的构 象有影响。 四、论文详细工作进度和安排 首先仔细阅读课题任务书通过各种渠道查找相关资料并随时随地做好笔记了解抗癫痫药物的种类及作用机理对血清白蛋白进行总体上研究与构思理解抗癫痫药物与血清白蛋白的相互作用展望药物分子与血清白蛋白相互作用研究发展方向最后思考检查是否有可以改的地方整体完成论文。 2010年 11月 2011年 1月初：收集资料，查阅相关资料，确定论文题目。 2011年 1月 2011年 2月中旬：在老师的指导下，写文献综述和开题报告。 2011年 3月 2011年 4月：做实验，整理数据，听取 老师意见，撰写论文初稿，交指导老师评审。

15、 2011年 4月：定稿。 五、主要参考文献 1北京医学附属人民医院胡椒治疗癫痫的初步经验 .北京医学院学报， 1974， 4： 214-219 2余军平荧光光谱法在药物分析及药物与生物分子作用中的应用研究 D武汉：武汉大学，2004 3 JOHN C C,DVAID D J,ROBERT R L.Fluorescence spectroscopy in biochemistry:teaching basic principles with visual demonstrationsJ.Biochem.Mole.Biology Edu.2001,29:60-65 4 BROWN M P,ROY

16、ER C.Fluorescence spectroscopy as a tool to investigate protein interactionsJ.Current Opinion in Biotechnology,1997,8:45-49 5 曾书霞 ,赵玉芬 .分子吸收光谱在生物大分子研究中的应用 J先谱学与光谱分析 ,2004，24(10):1197-1201 6 扬家祥 ,张玉葱 ,许兴友，等荧光光谱在蛋白质分子构象研究中的应用 J淮海工学院报 ,1999， 8(4):25-32 7李志良 ,陈建华 ,章开诚 ,李梦龙 ,俞汝勤 .中国科学 (B辑 )J,1991,11:1193

17、 8黄波 ,邹国林 ,杨天鸣 .化学学报 J,2002,60(10):1867 9卢继新 ,张贵珠 ,黄志娜 .分析试验室 J,2003,22(Supp1):485 10张贵珠 ,卢继新 ,黄志娜 ,张瑶舒 .稀有金属 J,2001,25(6):423. 11Silva D， Cortez C M， Louro S R Braz J Med Biol Res J， 2004， 37(7)： 963 12毕淑云 ,丁 兰 ,宋大千 ,田 媛 ,张寒琦 .化学学报 J,2005,63(23):2169 13杨曼曼 ,席小莉 ,杨频 .科学通报 J,2005,50(20):2199 14Papado

18、poulou A， Green R J， Frazier R A J Agric Food Chem J， 2005， 53(1)： 158 15刘雪峰 ,夏咏梅 ,方 云 ,邹 鲁 ,刘玲玲 .化学学报 J,2004,62(16):1484 16刘永明 ,李贵芝 ,孙希芬 .分析化学 J,2004,32(5):612 17刘保生 ,赵长容 ,张红医 ,王甫丽 ,杨更亮 .分析科学学报 J,2005,21(1):17 18杨朝霞，文艳清，张友玉，姚守拙 .川陈皮素与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究 .湖南师范大学化工学院， 2010. 19谢孟峡 ,蒋 敏 ,李 崧 ,刘 媛 .化学学报 J,2

19、004,62(16):1460 20刘媛 ,谢孟峡 ,康娟 .化学学报 J,2003,61(8):1305 21谢孟峡 ,徐晓云 ,王英典 ,刘媛 .化学学报 J,2005,63(22):2055 23 Chairs J B.BiochemistryJ,1986,25： 8364 24Kumar C V， Asuncion E H J Am Chem Soc J， 1993， 115： 8547 25李文友 ,朱守田 ,何锡文 ,梁 宏 .化学学报 J,2002,60(1):105 26Hopkins H P,Yang M ,wilson w D.BiopolymersJ,1991,31:11

20、05 27曹瑛 ,李一峻 ,高志 ,何锡文药学学报 J,1999,34(4):276 28Sulkowska A,Bojko B,Rownicka J.BiopolymersJ,2006,81(6):464 29Chen A,Shapiro M J.J.Am.Chem.Soc.J,1998,120:10258 30SHAHPER N.KHAN.BARIRA I,RAGOTHAMAN Y,eta1.Interaction of mitoxantrone witIl human serum albumin:Spectroscopic and molecular modeling studiesJ.Pharmaceutical Sciences， 2008,35,371-382. 31张朝红 ,臧树良 ,耿兵 ,铁梅 ,吴林友 ,苏欣 ,冯冲 .分析科学学报 )J,2005,21(2):179 32ShaikhSM,SeetharamappaJ,AshokaS.Chem.Pharm.Bul1.(Tokyo)J,2006,54(4):422 27Liu J,Tian J,Hu z,Chen X.BiopolymersJ,2004,73(4):443