白蔹三种不同萃取物的抗肿瘤活性研究[开题报告].doc

1、毕业论文 开题报告 生物 工程 白蔹三种不同萃取物的抗肿瘤活性研究 一、 选题的背景、意义 白蔹又名白根 ,五爪藤 ,山地瓜。始载于神农本草经 ,性微寒 ,味苦 1。 中华人民共和国药典 2005版收载的白蔹为葡萄科白蔹 Ampelopsis japonics( Thunb. )Makino 的块根 2。 白蔹原产我国的华北、华东和中南等省区，喜温暖湿润和阳光充足的环境，也耐荫，耐贫瘠和干旱，耐寒冷，但怕积水。白蔹块状茎具有清热解毒、消痈散结、生肌止痛之功效，可用于治疗痈肿疮疡、瘰疬、烫伤、扭挫伤等 ;外用也可用于 痈、疖、蜂窝组织炎、淋巴结炎等病症，常作药用植物栽培，近年将其作为观赏花卉引种

2、栽培 3。 白蔹入药历史悠久 ,早在名医别录中已有记载 ,是历代医家治疗疔痈的重要药物 4-5。 药理实验研究表明，白蔹的主要活性为抗菌性 ,许多新活性如免疫调节活性及抑制毛发生长作用等不断被发现。但是，多数药理活性研究还处于初级阶段，其真正起作用的物质尚未阐明，需进一步研究。 目前，从植物中寻求抗肿瘤活性物质现已成为抗癌药物的重要研究内容 6。例如紫杉醇、黄连、升麻等中药化合物，在临床上已经广泛被使用。本次实验研究白蔹的抗肿 瘤活性，其相关方面的研究甚少。针对三种萃取物对 HeLa细胞（人宫颈癌细胞）的抗肿瘤活性研究，还未见有相关报道。因此，本次实验的开展一方面为白蔹各种剂型的开发提供理论依

3、据，另一方面，也为进一步探索白蔹的药理活性打下基础。 二、相关研究的最新成果及动态 2.1 白蔹化学成分研究进展 现代研究发现，白蔹经 5乙醇渗漉提取后根据理化性质及光谱分析鉴定其化学成分为大黄素甲醚、羽扇豆醇、 p-谷甾醇、大黄酚、碳十六酸、大黄素、富马酸、胡萝卜甙、没食子酸、卫茅醇。大黄素甲醚、大黄酚、大黄素、富马酸、没食子酸具有抗菌和抗 真菌作用，这与中医药关于白蔹的临床应用相一致 7。 为了进一步阐明白蔹的化学成分，为白蔹的深层开发提供依据，郝军等 8从白蔹的乙酸乙酯萃取液中分离得到了 8个化合物。利用理化常数和波谱学方法 (1H NMR、 13C-NMR)鉴定了它们的结构，分别为没食

4、子酸、原儿茶酸、龙胆酸、白藜芦醇、大黄素、羽扇豆醇、 p一谷甾醇、胡萝卜甙。 郝军等 2又从其氯仿和乙酸乙酯萃取部分中分离得到了五味子苷 、大黄酚 、大黄素甲醚、大黄素 -8-O- -D-吡喃葡萄糖苷 、 poriferast-5-en-3、 7 -diol、棕 榈酸、齐墩果酸。 目前所见的研究大多数是从氯仿、乙酸乙酯等溶剂中萃取分离白蔹中的化合物。 2.2 白蔹的应用 2.2.1 白蔹的药理作用 (1)抗菌活性 抗菌是白蔹的主要活性，目前研究的较多。白蔹含有大黄素甲醚、大黄酚、大黄素、富马酸、没食子酸等多种抗细菌和真菌成分，与其临床应用相一致。白蔹的水浸液对同心性毛癣菌、奥杜盎氏小芽胞癣菌、

5、腹股沟和红色表皮癣菌等真菌有不同程度的抑制作用。水煎剂用平板稀释法对金黄色葡萄球菌有抑制作用 6。 将蛇葡萄根、白蔹等 4味中药的 70% 乙醇提取物制成外用蛇葡萄根霜剂 ，体外抑菌实验表明，此霜剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌有不同程度的抑制作用 5。口腔微生物通过腐败消化口腔内的滞留物质产生挥发性硫化物及其它异味物质导致口臭。朱彩莲等 9通过测定挥发性硫化物，发现白蔹对临床采集的牙周病口臭患者唾液细菌的抑菌率为45%。 (2)抗肿瘤 白蔹的甲醇提取物及从中提取纯化的 momordin对激活蛋白（ AP-1）活性及肿瘤细胞的增生有抑制作用。 momordin 对肿瘤细胞的抑制活性最

6、强，其 IC50 为 22.8 mg/ml。白蔹的甲醇提取物和 momordin还对人肿 瘤细胞有细胞毒作用， momordinI细胞毒作用最强， IC50 为 7.28016.05 mg/ml10-11。 Kim 等 11研究了 momordinI 对白血病 HL-60 细胞的细胞毒作用，其 IC50 为 19.0 mg/ml，并证明其作用机制是通过降低 Bcl-2:Bax的比例及激活 caspase-3，诱导了白血病 HL-60 细胞的凋亡。 许多中药乙醇提取物均有高度酪氨酸酶抑制作用，能阻截皮肤中黑色素的形成。唐海谊等 9发现，白蔹水提物对酪氨酸酶有很强的抑制作用。 (3)免疫调节活性

7、动物实验表明 12， 3 种不同剂量的白蔹醇提物（ 5， 10， 20 g/kg）对小鼠外周血淋巴细胞 ANAE阳性率、 T细胞增殖能力及巨噬细胞吞噬功能均有促进作用，并随剂量增加作用增强，量效呈正相关。作者认为，白蔹提取物可增强小鼠 T淋巴细胞和巨噬细胞的免疫功能，表明白蔹的抗菌作用与其免疫活性有关，临床用于抗感染治疗可能具有直接抗菌和调节集体免疫功能的双重机制。 (4)兴奋作用 赵翠兰 13观察了白蔹煎剂对小鼠给药前后电刺激的痛阈变化，发现白蔹煎剂对小白鼠有一定的兴奋作用，无镇痛作用。 (5)抑制毛发生长 白蔹的水煎剂对小 鼠触须毛囊生长有明显抑制作用。 2.2.2 白蔹的临床作用 白蔹属

8、于清热解毒药，苦辛微寒，归心、胃、肝经。苦寒能清热解毒，味辛能散结消痛，外用可敛疮生肌，可用于疮痈肿毒、烧烫伤。既可内服，又可外敷。 白蔹的临床应用有治疗癌性发热，治疗支气管扩张咯血，治疗手足皲裂，治疗烧伤，治疗骨折等。 三、 课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 3.1 研究内容及其目标 本课题是 对已获得的三种白蔹提取物进行体外抗肿瘤活性实验 ， 探究白蔹的抗肿瘤能力 ， 并比较三种萃取物的抗肿瘤活性能力大小。 3.2 采 取的研究方法 对 Hela细胞（人宫颈癌细胞） 进行培养至最佳状态，拟采用 MTT法测三种萃取物对癌细胞的抑制能力、计算和比较各萃取物的

9、IC50。 3.3 课题的研究难点 虽然实验步骤不多，但 细胞培养需要有认真负责的心态，每天都要观察细胞状态，并做出相应的处理，直到把细胞状态调到最佳，方能进行实验 。对操作者的无菌操作能力要求比较高。而 MTT实验需要大量的重复实验，要科学客观的分析每一次的实验数据， 缩小并最终 确定有效的药物浓度范围 。 3.4 实验方案 3.4.1 材料和仪器 Hela细胞（人宫颈癌细胞） 、培养 皿（ NEST)、倒置生物显微镜（ Nikon）、 全自动酶标仪 ( Model 680型 , 美国 BioRad 公司 );二氧化碳培养箱（日本三洋）、电热恒温 水浴锅 (上海精宏）、酒精灯、 50mL离心

10、管（ Corning)、血球计数板（上海安信）等； 3.4.2 试剂 RPMI1640培养基 (Hyclone)、 RPMI1640双抗溶液 （ Sigma）、 MTT（ Sigma）、 DMSO溶液（ Sigma)、 PBS缓冲溶液 (BOSTER)、 0.25%胰酶溶液 （ Hyclone)、 新生胎牛血清 （四季青）； 3.4.3 药物 白蔹的石油醚萃取物、乙酸乙脂萃取物、正丁醇萃取物； 3.4.4 方法 （ 1） 细胞培养 Hela细胞（人宫颈癌细胞） 由华东师范大学生命医学研究所提供。将 Hela细胞 培养于RPMI1640 完全培养基中 , 每 2天换液 1次 , 每 3天传代 1

11、次。细胞置于 37 、 5 CO2 饱和湿度的培养箱中 , 取对数生长期细胞用于实验。 （ 2） 单层培养细胞单细胞悬液的制备 弃去培养细胞 (对数生长期 )中的培养液，加入 3 4mL PBS 液 漂洗，弃去 PBS。再加入8001000L 37 胰蛋白酶 ， 倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时， 加入 12mLRPMI1640完全培养基 停止胰蛋白酶 消化细胞 作用。 最后 用吸管反复吹打，使其分散为单个细胞悬液 。 （ 3） 细胞接板及加药 取肿瘤细胞悬液，用血球计数板计数，调整细胞悬液浓度至 5104个 /mL,不断打匀并接种于 96孔细胞培养板，每孔加入 100L 细胞悬液，使得每孔细

12、胞数为 5000个。小心轻放 96孔培养板置培养箱温育（ 37、 5 CO2饱合湿度）。待细胞贴壁后 , 吸净培养基。每孔加入 98L完全培养基和各稀释度药物 2L ，使得药物终浓度为 10-1mg/mL、 10-2mg/mL、 10-3mg/mL、10-4mg/mL、 10-5mg/mL(根据具体需要调整浓度）。再平行设空白对照组 (2LDMSO 加 98L 培养基 )。以上各浓度和对照组均重复 5个孔。 （ 4） 加 MTT 测定 将 MTT 粉末在避光下用 PBS 缓冲溶液配制成 5mg/mL 的母液，避光保存在 -20 冰箱中待用。 加药 24h 后，小心取出 96孔培养板。吸去培养基

13、（尽量吸干净），在避光条件下每孔加入 90 L 空白培养基 和 10 L5mg/mL MTT 溶液，继续培养 4 h。小心取出板，吸尽上清液 , 每孔加入 150 L DMSO，再设三个本底对照孔（只加 150 LDMSO）。 不断振荡，充分溶解MTT 紫色还原产物。置酶标仪上于 490 nm 波长处测定各药物组、空白对照组和本底对照组的光密度 ( OD ) , 按公式计算得到药物对肿瘤细胞生长的抑制率 ( IR, % ) 和半数抑制浓度( IC50 ) 14-15, 并对药效进行初步的评价 : IR%= ( 1- （ O D 加药组 -ODDMSO） /（ O D 对照组 -ODDMSO）

14、)100% 四、论文详细工作进度和安排 2010.11.2 2010.12.2 熟悉基本实验操作； 开题，相关资料的搜集和 文献综 述的写作； 2010.12.3 2010.12.20 Hela 细胞（人宫颈癌细胞）培养和化合物的陪住 ； 2010.12.21 2011.1.1 MTT 法初试，确定有效的药物浓度范围 ； 2011.1.2 2011.2.1 缩小测试浓度范围，分别计算出各萃取物对 Hela 细胞的 IC50； 2011.2.2 2011.3.24 实验 数据处理和论文写作 ； 2010.5.31 完成并提交毕业论文； 2010.6.5 在 学校指定时间进行毕业论文答辩； 201

15、0.6.7 完成并提交答辩后的修改论文； 参考文献 1 林慧君 ,陈卫 .白蔹多糖 PAJM-的分离纯化和结构分析 J. 海峡药学 ,2008;20(4):102-104. 2 赫军 ,畅晓兵 ,杨旭 . 白蔹的化学成分 ( )J. 沈阳药科大学学报 ,2009;26(3):188-190. 3 兑宝峰 . 药用花卉 -白蔹 J. FLOWERS,2008;11(2):188-190. 4 季宇彬 . 抗癌中药药理与应用 M.哈尔滨 :黑龙江科 学技术出版社 ,1999,446-447. 5 Kim JH,Ju EM ,Lee DK,Hwang HJ.Induction of apoptosi

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