α-淀粉酶的研究及应用[文献综述].doc

1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 -淀粉酶的研究及应用 淀粉酶是一种 水解酶 ，是目前 发酵工业 上应用最 广泛的一类 酶 。淀粉酶一般作用于 可溶性淀粉 、直链淀粉 、 糖原 等 -1,4-葡聚糖，水解 -1,4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为 -淀粉酶 （ EC3.2.1.1.）与 -淀粉酶 （ EC3.2.1.2.）。因 -淀粉酶 作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开 -1,4 糖苷键，生成糊精和还原糖，而 -淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断 -1,4-葡聚糖链生成分子量比较大的极限糊精 ，且 -淀粉酶 分布更广泛，已是一种十分重要的酶制剂， -淀粉酶大量应用于粮食加工、食

2、品工业、酿造、发酵、和医药行业等，它占了整个酶制剂市场份额的 25%左右 1。目前工业生产上都以微生物发酵法大规模生产 -淀粉酶。但随着社会需求的增大 ， 工业生产对 -淀粉酶的需求量也越来越大 ， 急需寻找满足生产需要的具新型特征的酶制剂。因此本文主要讨论以 -淀粉酶为代表的淀粉酶的研究及应用。 1 -淀粉酶的研究 1.1 -淀粉酶分离纯化方法的研究 高纯度 -淀粉酶是一种重要的水 解淀粉类酶制剂 ， 可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常数等。分离纯化 -淀粉酶的方法很多 ， 一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度的 -淀粉酶

3、， 往往需要将各种方法联合使用。盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等 ， 是蛋白质分离纯化的主要方法。用吸附树脂法、 40%乙醇从 -淀粉酶发酵液中分离高活性 -淀粉酶，用离子交换法和透析法对初酶液进行脱盐处理，最后用 DEAE纤维素纯化 淀粉酶，所得酶活力为 60153U/g，酶活性 回收率为 66.04%2。另通过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析等方式 ， 从白曲霉菌 A. kawachii 的米曲粗抽出液中 ， 分离纯化到两个耐酸性 -淀粉酶比活性极高的组分。用疏水吸附法和DEAE-cellulose(二乙氨基乙基 -纤维素 )柱层析法分离纯化 -淀粉

4、酶 ， 所得酶活力为 110 000 U/g。用硫酸铵沉淀和垂直板制备凝胶电泳对地衣芽孢杆菌 A. 4041 耐高温 -淀粉酶进行分离纯化 ， 得到 3种电泳均一的组分。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳 ， 对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性 -淀 粉酶进行纯化 ， 得到电泳纯级的超耐热耐酸性 -淀粉酶 ， 纯化倍数为 11. 7，活力回收率为 29. 8%3。但上述方法存在的共同问题是 ， 连续操作和规模放大都比较困难。双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相系统 PEG/磷酸盐分离2 纯化 -淀粉酶 ， 增加 PEG 浓度有助于酶富集上相

5、。同样用 PEG/磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分离低温 -淀粉酶 ， 分配系数及回收率分别为 4. 8 和 87%4。 PVP(聚乙烯吡咯烷酮 )和硫酸铵对酶活力具有保护作用 ， 利用 PVP/硫酸铵液 -固萃取体系分离 提取耐高温 -淀粉酶 ， 酶活力回收率高 ，体系成相时间短 ， 操作时不需双水相体系所用的分液漏斗和离心操作 ， 用倾液法即可实现相分离 ，因此 ， 与双水相体系相比 ， 液 -固萃取体系具有更大的优越性 5。 1.2 -淀粉酶活力测定方法的研究 测定 -淀粉酶活力的方法已不少于 200 种 ， 其共同之处是 ， 被测样品与某种多糖底物溶液保温反应后测之 ， 很难标准化

6、。碘 -淀粉比色法测定 -淀粉酶活力的优点是 ， 操作简便 ， 试剂便宜 ， 比色精确、敏感。因此 ， 成为受推荐的淀粉酶活力测定方法。盛勤芳 6提出要提高糖化型淀粉酶活力测定的准确性须 注意酶反应时间的选择和酶的控制。严控制测定时间十分重要，为了保证 10min 内（初速度时间范围内） 50 ，底物（淀粉液）必须预保温 5-10min。为了能得到准确的测定结果，在实验设计中，对空白与样品滴定值之差（ B-A）一般控制在 1.0-2.6ml；若（ B-A）小于 1.0ml，表明酶浓度过小；若（ B-A）大于 2.6ml，表明酶浓度偏高。（ B-A）这个值可以通过调整酶的稀释倍数，使之控制在 1

7、.0-2.6ml 范围内。 1.3耐高温 -淀粉酶的研究 大多数淀粉酶生产的研究是以 25-37 7， 8的温度范围的中温菌开 展的。但是为了节约生产成本，-淀粉酶最好在高温糊化（ 100-110 ）和液化（ 80-90 ）过程中保持活性，因此有必要寻找耐更高温度的耐高温 -淀粉酶。 生产耐高温 -淀粉酶的菌种有地衣芽孢杆菌、枯草杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝聚芽孢杆菌、酸热芽孢杆菌以及普通高温放线菌等。解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌是最常用在温度 37-60 9生产淀粉酶的芽孢杆菌。海洋红嗜热盐菌，作为一种海洋嗜热菌产生 -淀粉酶最高耐热温度为 61 10。用随机整

8、合法在地衣芽孢杆菌中表达了耐高温 -淀 粉酶基因 ， 筛选出的阳性菌中 -淀粉酶基因表达水平比供体菌提高了 20 倍 11。对超嗜热菌强烈火球菌的 -淀粉酶 PFA 基因序列进行密码子优化在巴斯德毕赤酵母中高效表达，得到 -淀粉酶活力最高为 220 U/L12。 1.4耐酸性 -淀粉酶的研究 目前 ， 国内外市场中常用的淀粉酶为中温、高温以及碱性 -淀粉酶 ， 在酸性条件下 ， 其酶活性降低很明显 ， 甚至失去活性。随着我国淀粉质原料深加工工业的发展 ， 工艺条件的不断改变 ， 一些淀粉原料深加工工艺需要在较低的 pH 值条件下进行。所以 ， 开发新型耐酸性 -淀粉酶迫在眉睫。 自 1963

9、年日本学者首次发现耐酸性 -淀粉酶以来 ， 能产生耐酸性 -淀粉酶的微生物大多为芽3 孢杆菌和曲霉。从酒曲中选育得到的嗜酸性的黑曲霉产酶菌株 Tx-78，通过液体发酵 ， 酒精沉淀以及二次离子交换层析得到最适 pH 为 4. 0， 最适反应温度为 70 ， 具有良好的耐酸性和热稳定性的耐酸性 -淀粉酶制剂 13。蔡恒等 14把 -淀粉酶的基因改造后 ， 克隆到穿梭质粒 pBE2 中 ， 构建了含突变 -淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体 pBSAT， 含有 pBSAT 的菌株可将突变 -淀粉酶分泌到胞外 ， 分泌的 -淀粉酶具有较高的耐 酸性。 2 淀粉酶的应用 2.1 在食品工业中的应用 各种酶

10、制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史 ， 最近几十年 -淀粉酶广泛地应用于焙烤工业中 -淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大 ， 纹理疏松；提高面团的发酵速度 ;改善面包心的组织结构 ， 增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色泽 ;提高入炉的急胀性；抗老化 ，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期。 目前 ， 焙烤工业使用的 -淀粉酶主要来自大麦麦芽、真菌和细菌。 1955 年 ， 美国批准真菌 -淀粉酶作为面包添加剂。 1963 年 ， 英国证实了它们的安全性 15。现在 ， -淀粉酶已经在全世界范围内使用。 2.2 在造纸工业中的应用 淀粉酶在造纸工业中的用途主

11、要是改良纸张涂层淀粉，由于造纸施胶过程中要保持淀粉乳的粘度 ， 压扎机也要根据所造纸的级别来调整施胶的粘度 ， 而且天然淀粉的粘度较高需经处理降低其粘度后才能用于表明施胶 ， 因此需要用 -淀粉酶间歇式或连续降解淀粉来调整淀粉乳的粘度。 2.3 在清洁剂生产中的应用 酶是现代高效清洁剂的成分之一。酶在清洁剂中最大的功能就是使清洁剂更温和无害。早期的自动洗碗机的清洁剂非常粗糙，容 易在进食时对人体造成伤害，而且对陶瓷、木质餐具也会造成损害。而将酶制剂用于清洁剂以后 ， 可以在较低的清洗温度下就到达很好的清洗效果。 1975 年 ， -淀粉酶开始用于洗衣粉中。现在 ， 几乎 90%以上的液体清洁剂

12、中都含有 -淀粉酶 16。 2.4在医药行业中的应用 从最早的 J. Takamine 博士第一个使用米曲霉进行 -淀粉酶工业生产，这一淀粉酶被称之为塔卡淀粉酶作为一种助消化剂开始，淀粉酶在医药行业的应用主要是作为助消化剂 17。黑曲霉 -淀粉酶因具有耐酸性 ， 适用于制造助消化的药物 ， 开发适合于胃酸性环 境 (pH2. 0 左右 )的耐酸性 -淀粉酶 ，用于制备消化助剂 ， 将会使医疗效果更为有效 18。另外分析血链球菌群中的细菌与 -唾液淀粉酶的结合能力 ， 可有效鉴定不同血链球菌群中各菌株。研究唾液 -淀粉酶与致龋血链球菌粘附的关系 ，4 为龋病的病因学研究和预防提供了理论依据 19

13、。 3 结论 综上所述， -淀粉酶是使用最广泛的酶之一。除食品和淀粉行业对它们的需求不断增加，同时它们也用在诸如纸张纸浆、清洁剂和医药等其他行业。由于应用领域的扩大，对特异性的淀粉酶的需求越来越多。许多研究者对其进行了深入的研究，现 研究重点放在了发展微生物 -淀粉酶的耐热性和耐酸碱性上，这将扩展其使用的范围 ， 提高使用效率。无论如何 ， 随着科技的发展、研究的深入 ， 淀粉酶将会得到更加广泛的应用。 参考文献 1 孙晓菲 ,李爱江 -淀粉酶的应用及研究 J畜牧兽医科技信息， 2008(6):13-14 2 凌家俭 ,王宁 ,王林涛高活性 -淀粉酶的分离与纯化 J苏州大学学报 (医学版 )2

14、009， 29(5)：930-932 3 李辉 ,郭建强 ,岳丽丽 ,等 .重组超耐热酸性 -淀粉酶的分离纯化及其性质研究 J.微生物学报 , 2005, 45(4): 547-550 4 房耀维 ,刘姝 ,吕明生 ,等 .双水相萃取法分离低温 -淀粉酶的研究 J.食品科学 , 2009, 30(18): 159-162 5 张剑 ,张开诚 ,陈立 .液 -固萃取法提取 -淀粉酶的研究 J.化学与生物工程 , 2004(6): 39-41 6 盛勤芳糖化型淀粉酶活力测定中的几点体会 J科技信息， 2009(26):13 7 S. Ramachandran, A.K. Patel, K.M. N

15、ampoothiri, F. Francis, V. Nagy, G. Szakacs, A. Pandey, Coconut oil cake - A potential raw material for the production of a-amylase, Bioresour. Technol. 93 (2004) 169174. 8 F. Francis, A. Sabu, K.M. Nampoothiri, S. Ramachandran, S. Ghosh, G. Szakacs, A. Pandey, Use of response surface methodology fo

16、r optimizing process parameters for the production of a-amylase by Aspergillus oryzae, Biochem. Eng. J. 15 (2003) 107115. 9 S. Mishra, S.B. Noronha, G.K. Suraishkumar, Increase inenzyme productivity by induced oxidative stress in Bacillus subtilis cultures and analysis of its mechanism using microar

17、ray data, Process Biochem. 40 (2005) 18631870. 10 I. Gomes, J. Gomes, W. Steiner, Highly thermostable amylase and pullulanase of the extreme thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus: Production and partial characterization, Bioresour. Technol. 90 (2003) 207214. 5 11 杜冰冰 ,郝帅 ,李运敏 ,等 .高温 -淀粉酶基因突变

18、体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达 J.微生物学报 , 2006, 46(5):827-830 12 韦宇拓 ,汪嵘 ,杜丽琴 ,等 .合成耐高温 -淀粉酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达 J.中国生物工程杂志 , 2005, 25(1): 65-69 13 李勃 ,党永，马瑜等 . 黑曲霉 Tx-78 耐酸性 -淀粉酶的分离纯化及其性质研究 J. 微生物学杂志 ,2008,28(4) :30-34 14 蔡恒 ,陈忠军 ,李金霞 ,等 .-淀粉酶的奶酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达 J.食品与发酵工业 ,2005,31(10):33-36. 15GuptaR,GigrasP,Mohapatr

19、aH,etal.Microbial-amylases:abiotecn-ologicalperspectiveJ.ProcessBiochemistry,2003,11(38):1599-1616 16 罗志刚 ,杨景峰 ,罗发兴 -淀粉酶的性质及应用 J食品研究与开发， 2007,28(8):163-165 17Sivaramakrisshan S , Gangadharan D, Nampoothiri K M, et al. -Amylase from microbial sources-an overview on recent development. Food Technol. BiotechnolJ.2006, 44 (2) , 173-184 18 陈远钊 ,罗 俊成 ,胡佳 ,等 .酸性 -淀粉酶菌株的诱变及酶的性质研究 J.中国酿造 , 2007(1): 10-13 19 邓淑丽 ,韩曙光 ,陈晖等 .应用 -唾液淀粉酶结合能力鉴定血链球菌 J.浙江预防医学 , 2004, 16(2): 14-15