甘草多糖提取过程中除蛋白方法研究[文献综述].doc

1、1 毕业论文 文献综述 生物工程 甘草多糖提取过程中除蛋白方法研究 1 前言 多糖是除核酸和蛋白质之外的另一类重要的生命物质，广泛存在于动物、植物、微生物等有机体中，具有能量储存、结构支持、防御功能等多方面的生物功能：同时多糖联系着细胞与细胞之间及细胞与外界的能量和物质传递，决定着大分子与细胞及与其它分子之间的相互作用。近年来，植物、海洋生物及菌类等来源的多糖己作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，各种多糖所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。据 Franz 等报道1，已有近百种 植物的多糖被分离提取鉴定出来，这类多糖来源广泛且没有细胞毒性，应用于生物体毒副作用

2、小，因此多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点，糖生物学也被称为“生物化学最的巨大前沿之一”，成为继基因组学、蛋白质组学滞后的另一研究热点。多糖结构复杂，其生物活性与其纯度和化学结构有着重要的关系。因此，对多糖的研究开发包含了多糖的提取，分离、纯化。 甘草属 (Glycyrrhiza L)植物为豆科蝶形花亚科多年生草本植物。该属植物共有 29 种 6 变种，我国产 18 种 3 变种，其中乌拉尔甘草 (G uralensis Fisch )、胀果甘草 (Glycyrrhiza inflata Bat )和光果甘草 (Glycyrrhiza glabra

3、 L )被各版中国药典收载，为传统中药甘草的来源。甘草作为我国最常用传统中药之一，素有“十方九草”之称，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效，民间用于治疗乳腺炎、胃及十二指肠溃疡、脾胃虚弱、咳嗽、肝炎、咽喉肿痛、食物中毒等症 2。 2 甘草多糖 2.1 甘草多糖 的化学组成 前苏联学者曾对光果甘草 (Glycyrrhizaglabra L )和粗毛甘草 (Glycyrrhiza asperaPall )的地上部分和根中的多糖进行比较研究，结果表明两者地上部分分2 别含水溶性多糖 0 8和 4 0，果胶含量均为 5 8，其多糖组分也相似，均由鼠李糖、萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、

4、葡萄糖和半乳糖组成，而光果甘草根中的水溶性多糖则为 1 6 f3。赵秀英等进一步证实乌拉尔甘草种子中的多糖为半乳甘露聚糖，其摩尔比为 1： 2 06。刘丙灿等从乌拉尔甘草根的稀碱提取液中分离得到一种分子量为 4000Da、无分支的 a-D-(1-4)葡聚糖。周蓉等对乌拉尔甘草多糖分离 纯化后，样品经高效毛细管电泳分析表明，该多糖组分由鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，并以葡聚糖为主链 4。 2.2甘草多糖药理作用研究概况 2 1免疫调节作用 Tomada等研究从乌拉尔甘草根中分得的多糖 UA、 UB、 UC及西北甘草匍匐茎中的多糖 GA的活性，发现 UA、 UC和 GA具有相当强的抗补体活

5、性和碱性磷酸酯酶诱发活性， UB的活性相对较弱 5。 Zhao， J E等发现乌拉尔甘草根中的水溶性粗多糖 GR具有抗补体，促有丝分裂和增强清除免疫复合物活性，经溴化十六烷基三甲胺作用后产生的 5个组分中，含 60半 乳糖醛酸的 GR-2免疫调节作用最强，抗 补体活性和促有丝分裂活性可能是由多糖复合物中的聚半乳糖醛酸部分引起 6。 Yamada等研究发现含乌拉尔甘草等 10种草药的日本复方药 Juzen-Taiho To具有免疫调节活性，其中的甘草多糖活性最强，过碘酸氧化后活性则降低 7。Kiyohara， H进一一步证实 Juzen-Taiho To的激活补体、促有丝分裂、增强 IL-2产生

6、能力等活性与其中来自乌拉尔甘草等草药的多糖的精细结构有关。果胶类、果胶阿拉伯半乳聚糖的中性 l， 6-半乳糖和杂多糖侧链对其激活补体、促有丝分裂活性的影响较大，而聚鼠李半乳糖醛酸 II型多糖经硼酸盐二酯作用产生的二聚体与其 IL-2产生能力 的增强有关 8。 有实验对甘草多糖及高碘酸氧化还原产物，控制 Smith降解产物的抗补体活性和碱性磷酸酯酶的诱发活性进行了研究，结果控制 Smith降解产物呈现明显的活性 9。还有实验表明，从甘草的酸性多糖组分中分离的 3种酸性多糖 (GR-2IIa，GR-2IIb， GR-2IIc、 )，具有明显的抗补体活性，且 GR-2IIc具有促有丝分裂活性。GR-

7、2IIc结构中的鼠李半乳糖醛酸聚糖核心 PG-1能够激活内毒素介导的凝结 因子， 鲎变形细胞溶解物试验 (LAL)显阳性，与甘草多糖的抗补体、促有丝分裂、3 调节 巨噬细胞 Fc受体兴奋性等活性有关 10。 Hwang Bng-Hyum等对乌拉尔甘草根中的粗多糖 GU-3及其分离纯化组分的活性研究表明， GU-3能促进派尔斑介导的骨髓细胞增殖能力，增强 NK-cell介导的肿瘤细胞毒性，这是由其中的果胶阿拉伯半乳糖醛酸和果胶类引起的 11。郑尧等人采用印度墨汁廓清实验法测定甘草多糖对小鼠网状内皮系统 (RES)中的单核巨噬细胞系统功能的影响。结果表明 GPS能提高小鼠 RES功能，不仅对特异性

8、免疫功 能有促进作用，而且对非特异性免疫功能亦有增强 12。另有研究表明，GPS还具有类似 LPS的作用，能刺激小鼠腹腔巨噬细胞活性，且呈作用剂量依赖关系；主要表现为 GPS能刺激巨噬细胞的吞噬能力、能量代谢水平增强以及 IL-1、IL-6、 IL-12含量的显著升高 13。甘草多糖还具有激活小鼠淋巴细胞增殖作用，且呈作用剂量依赖关系，可作为小鼠 B淋巴细胞非特异分裂原 14。甘草多糖对ConA诱导的淋巴细胞增殖也有较好的促进作用 15。 2 2抗肿瘤作用 甘草多糖具有一定的抗肿瘤活性，可以延长腹水瘤小鼠的生存期，抑 制实体瘤的生长。甘草多糖对于小鼠 S180肿瘤也具有抑制作用，可影响 bcl

9、-2、 p53及 bax基因蛋白的表达，这可能是甘草多糖抑瘤作用的一个重要机制 16。甘草多糖对S-180荷瘤、艾氏腹水瘤也有明显的抑制作用， 能够显著延长荷瘤小鼠的生命，且对雄性小鼠的抑瘤作用优于雌性小鼠 17。 史玉荣等采用 ANNEXINV-FITC加 PI双标法和 PI单标法行流式细胞仪检测甘草多糖对小鼠 S-180肉瘤的凋亡诱导作用，凋亡率分别为 1.0g kg组 24 7；0 75g kg组 23 2； 0 5g kg组 44 6；表明 甘草多糖有明显的诱导凋亡作用。同时证实低剂量甘草多糖通过诱导小鼠 S-180肉瘤凋亡来抑制肿瘤生长，而阴性对照组环磷酰胺对照组杀伤小鼠 S-180

10、肉瘤则是以导致细胞坏死为主 18。 2 3抗病毒作用 常雅萍等从甘草中提取甘草多糖对 7种 RNA和 DNA类病毒作了体外抗病毒研究，结果表明， GPS对水疱性口炎病毒 (VSV)、腺病毒 3型 (AdVIII)、单纯疱疹病毒 1型 (HSV-1)和牛痘病毒 (VV)均有明显的抑制作用，不但可直接灭活上述 4种病毒，而且对细胞内的病毒也有作用，可阻止 VSV、 AdV I吸附与进入细胞。GPS还对病毒复制有一定抑制作用 19. 4 王岳五等用甘草多糖 (GPS)作为抗病毒制剂，检测其抗牛艾滋病病毒 (BIV)、腺病毒 3型 (AdVIII)、柯萨奇病毒 (CBv3)作用。结果表明 GPS对三种

11、病毒均 有较明显的拮抗作用，对艾滋病病毒的抑制率为 36 2，可影响病毒合胞体形成，达到保护细胞作用。 GPS还可影响腺病毒和柯萨奇病毒的吸附及进入细胞的功能，达到保护细胞作用，其保护率分别为 74 5和 59%，因此可认为 GPS可吸附于细胞表面或进入细胞内，以防止病毒的吸附和进入，可适用于预防病毒感染和治疗 20 2.2 甘 草多糖的提取 2.21甘草粗多糖的提取 1，热水浸提法 称取 100g 甘草原料，粉碎后装入两个 1000ml 的大锥形瓶中，向每个锥形瓶中加入 500ml 蒸馏水，放入恒温水浴中， 80浸提 2 小时后，离心，收集上清液，重复操作三次，合并上清液，用旋转蒸发仪减压浓

12、缩，浓缩至 1/5 体积，得到甘草多糖浓缩液，加 95%d 的乙醇至含乙醇达 80%，离心，收集沉淀物，依次用无水乙醇，你同，乙醚洗涤沉淀 3 次，沉淀经冻干后得粗甘草多糖。 2，超声波法提取 取 甘草 100 克，粉碎成 10-20 目大小，放入 1000ml 的锥形瓶中，加水 500ml,水的量最好溢过 甘草 表面 2 厘米左右，放入超声波仪中，提取 30 分钟，过滤，重复一次，合并滤液 2.22 精多糖的提取 1Sevag 法： 取甘草定溶液加入试管中，并向此溶液中加入其体积 1/5 的氯仿 正丁醇（ 5:1）溶液，震荡 30min，经离心去除沉淀，脱蛋白。脱离心，取上清液，加95%的乙

13、醇至含醇量达 80%，离心，收集沉淀。依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤沉淀，沉淀物干燥后得出多糖。 2 酶法： 准确称取胰蛋白酶 2g，用 PH8 的蒸馏水溶解，置于 100ml 容量瓶中。精确配置 0.02g/ml 的多糖溶液， 取 10ml 置于锥形瓶中，调节 PH 为 8。将样品液于酶夜放置 37水浴锅中预热 10min，然后分别吸取酶液置于锥形瓶中再分别加入5 蒸馏水。 37恒温振荡器中震荡 30min 后，放入 100水浴锅中灭酶 10min。冷却至室温，加 95%的乙醇 40ml，离心，收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤沉淀，沉淀物经干燥后得到甘草多糖。 3 三氯乙酸法 取 5

14、0ml 甘草多糖溶液置于锥形瓶中，加入 5ml 的 40%三氯乙酸溶液，混匀放置，离心取上清液，加入 95%乙醇 200ml，离心，收集沉淀物，依次用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤沉 淀，沉淀物干燥得到多糖。 3 结论 各国学者对甘草化学成分提取研究十分青睐 ,但多数只注重于三萜类和黄酮类化合物的提取 ,而对甘草多糖的研究较少。本研究主要是对各种甘草多糖的提取方法进行终结并提出最优方案。实验表明酶法对甘草多糖的提取有着显著作用。根据正交实验结果得出酶量 2%温度 40，时间 1h， PH8时甘草多糖的产量最大。甘草多糖的药用价值表明其未来是光明的 4 参考文献 1 热娜 卡斯木 胀果甘草多糖的提取与

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