甘草有效成分的分离与纯化的研究进展[文献综述].doc

1、 1 毕业论文 文献综述 生物工程 甘草有效成分的分离与纯化的研究进展 1 前言 甘草是临床最常应用的药品。生甘草能清热解毒，润肺止咳，调和诸药性；炙甘草能补脾益气，临床用量特大，出口量大。除药用之外，食品上也大量用甘草做糕点添加剂，它的甜度是蔗糖的百倍。甘草的主要有效成分为甘草酸 (glycyrrhizic acid)或甘草甜素 (glycyrrhizin)及甘草次酸 (gly-cyrrhetinic acid)等三萜类化合物、甘草黄酮类化合物以及甘草多糖等 1-2。研究表明 3，甘草酸及甘草次酸具有解毒、消炎、镇 痛、抗肿瘤的作用，还用于防治病毒性肝炎、癌症以及艾滋病等。 我国甘草资源丰富

2、，具体分布情况如下表 1.14-5 表 1-1中国甘草资源的分布情况 乌拉尔甘草 新疆、甘肃、青海、陕两、宁夏、内蒙占、河北、山西、山东、辽宁、黑龙江 , 光果甘草 新疆和青海 胀果甘草 新疆 刺果甘草 黑龙江、辽宁、内蒙古、河北、山东、江苏、河南、陕西 粗毛甘草 仅分布在新疆的东部和北部 黄甘草 甘肃 云南甘草 云南、四川等高寒地区 侧果甘草 新疆 甘草的主要有效成分为草酸 (glycyrrhizic acid)或甘 草甜素 (glycyrrhizin)及甘草次酸(gly-cyrrhetinic acid)等三萜类化合物、甘草黄酮类化合物以及甘草多糖等。此外，国内外对甘草及其制剂药理与临床应

3、用方面也进行了研究。本文就甘草的有效成分的分离及纯化，药理作用等方面的最新研究加以概述。 2 甘草的化学成分概述 2.1 地上部分化学成分研究 2.1.1 黄酮类成分 2 有研究证明，已发现了 160多种甘草黄酮类化合物，药用作用优于甘草甜素 6，从云南 甘草中已分离出 12种化合物，刺果甘草中分离得 42种化合物用。 2.1.2 其它 化学成分 1989年日本 Toshio从黑龙江产乌拉尔甘草的地上部分分离得到 1个香豆素类成分，后来又分离到 5个其他酚类衍生物。贾世山等从内蒙古自治区西部地区产乌拉尔甘草叶分离到 1个酚酸甙类成分。而且甘草的地上部分租蛋白、粗脂肪含量高，粗纤维含量较低，饲喂

4、效果与紫花苜蓿相似，产出报酬略高于紫花苜蓿，为一种优良的豆科牧草，具有其它牧草所不具的双重作用。 2.2 地下部分化学成分研究 近年来我国学者对甘草根及根茎化学成分作了大量的研究，先后从甘草属植物中提取、分离、鉴定了 200多种化学成分，其中三萜类化合物和黄酮类 化合物是主要成分 7，此外还有香豆素类，多糖、生物碱、氨基酸等。 2.2.1 三萜类 8-9 甘草中的三萜类成分绝大多数为五环三萜齐墩果烷型， Cz8的取代分为 n和 8两大系列，由于 E环构象不同， a和 B异构体生理活性有时存在明显差异，一般 B异构体的生理活性明显大于 a的活性。该类化合物具有含量高、生理活性强的特点，据分析，含

5、量为 5 -1 l不等。到目前为止，在甘草属植物中已鉴定到 60多种三萜类化合物。 常见的甘草三萜类化合物有甘草酸 (Glycyrrhizic acid)、甘草次酸 (Glycyrrhitinic Acid)、乌拉尔甘草皂苷 A、 B(UralsaponinA、 B)，其结构见图 1-2。 甘草次酸： R=H 甘草酸： R=2分子葡萄糖醛酸 3 乌拉尔甘草皂苷 A： R=2分子葡萄糖醛酸 乌拉尔甘草皂苷 B： R=2分子葡萄糖醛酸 图 1-2甘草中三萜类成分的化学结构 甘草酸一直被认为是甘草中最重要的三萜类化合物，中国药典把甘草酸的量作为评价甘草药材及其制品质量的重要指标，通常要求不低于 2。

6、纯品甘草酸为白色晶体， mp220 , 27D +46.2 (乙醇 )，易溶于热的稀乙醇、丙酮，几乎不溶于无水乙醇和乙醚，其水溶液有微弱的起泡性及溶血性，加热、加压及在稀酸作用下可水解为一分予甘草次酸和两分子葡萄糖醛酸。因甘草酸分子中有 3个羧基，因此在植物体中可能以钾盐或钙 盐的形式存在。 为便于食用，一般制成易溶的盐，称为甘草甜素 (glycyrrhizin， GL)，其甜度约为蔗糖的200-300倍，少量甘草甜素与蔗糖并用可节省 20蔗糖而其甜味不变，其甜昧特点是甜味来得缓慢，但存留时间长，并具有特殊气味。甘草甜素已用于处理输出用的血制品以预防因输血而引起的艾滋病病毒 (HIV)传播，已

7、获美国专利。国际卫生和粮农组织食品添加剂法规委员会将甘草甜素列入使用名单。其中甘草酸单钾盐有某些抗凝作用，用于乙肝治疗的免疫增强剂；甘草酸钙盐 (经脉注射 )可增加茶碱的利尿作用，防止膀胱结石的形成 ；甘草酸铋钾能够有效地治疗溃疡；甘草次酸及盐类有明显的抗利尿作用；乙酰甘草次酸铝是一种消炎、抗溃疡的新药。 甘草中甘草酸含量随产地以及株龄的不同存在差异，乌拉尔甘草中甘草酸的含量相对较高，一般随株龄的增加甘草酸含量逐渐增加，甘草最佳采取期为 4年生株龄。甘草的不同部位甘草酸含量亦有明显差别，其中根部含量最高，叶次之，茎部的含量最少，分别为 :4.5-13.3， 1.26-1.74， 0.58-0.

8、87。 甘草酸具有促肾上腺皮脂激素作用，能减少尿量及钠的排出，增加钾的排出，可用于消炎解毒、镇咳、抗菌，具有抗变态 反应、免疫调节、抗病毒、抗溃疡、抗肿瘤、抗氧自由基等多种药理生物学作用，近年的药理研究还发现甘草酸具有保肝、防治病毒性肝炎、高血脂症和癌症等疾病的作用，引起了国内外学者的广泛关注。目前，已临床应用于治疗慢性乙型4 肝炎、胃及十二指肠溃疡、血小板减少性紫癜、流行性腮腺炎等疾病。 除用作药物外，还在食品、酿造、饮料、糖果以及调味品工业上用作矫味剂，还可作为调味剂 (与食盐配合使用效果特别明显 )、香味增强剂 (乳制品、可可制品、蛋制品、羊肉除膻增香用 )等，我国民间惯用予酱及酱制品中

9、。甘草酸作为食品添加剂不仅可以增甜调味、 抗氧化，而且是一种具有生理活性，有抑菌、消炎、解毒、除臭等多种功能的食品添加剂。我国国标 GB2760-86规定允许甘草酸作为罐头、调味品、糖果、饼干、蜜饯的甜味剂，用量“视正常生产需要而定”。 甘草酸还被广泛的使用在日用化工中，因其分子中含有亲水性基团和亲油性基团，能降低水溶液表面张力，有很强的发泡性，具有乳化、分散、保湿润发、软化皮肤、抗皱、抗皮脂、防治色素沉积、消炎止痒及洗涤去污的效果，适用于高级发用或肤用化妆品中，既有美容护肤效果，又有消炎、抗变态反应和治疗皮肤病的作用，还用作牙膏、洗漱液、沐浴液的原 料，是一种优良的天然原料。 2.2.2 黄

10、酮类 甘草黄酮 (glycyrrhiza flavonoids， FG)是从甘草提取物中得到的一类生物活性较强的成分，许多学者对其化学成分进行了大量的研究工作，在从甘草属植物中分离出的 100多种黄酮类及其衍生物中，苷元 70多个。这些黄酮类化合物分别属于黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄酮烷、二氢黄酮、二氢异黄酮等衍生物。黄酮类化合物的基本骨架可大体分为 10种，在文献中有详细的描述。所得的苷类主要包括：黄酮苷，如夏佛托苷 (schaftoside)、二氢酮苷，如甘草苷 (1iquiritin)：查耳酮苷，如异甘草苷 (isoliquiritia)：异黄酮苷，如芒柄花苷 (ononin)等。常见的黄酮

11、及黄酮苷类的结构如图 1-3。 (I)甘草素： R=OH； 甘草苷： R=O-glu ( )异甘草素： R=OH； 异甘草苷： R=O-glu 图 1-3常见黄酮类化合物的结构 研究发现，与维生素 E和甘露醇的抗氧化作用比较，甘草黄酮在清除氧自由基的作用上明显优于维生素 E；对 Fenton反应生成的羟自由基具有较强的直接清除作用，该作用明显优5 于甘露醇。甘草中黄酮类化合物中抗菌成分较多、作用较强。其中黄酮单体化合 licochalcone A,ficochalcone B,glabridln,gIabrene等对革兰阳性菌中的金葡球菌和枯草杆菌的抑制作用相当于链霉素：对酵母菌和真菌抑制作用

12、高于链霉素：对链霉素无效的白色念球菌有不同程度的抑制作用，对金黄球菌也有抑制作用。另据日本学者报道，甘草黄酮能加强人体免疫缺陷病毒 (HIV)对 ATL2IK(来源于成人 T细胞性白血病患者的细胞株 )的拮抗作 用，其中 2种新甘草查儿酮低浓度时显示出 HW增殖的抑制作用。带抗菌功效的原料是目前美白化妆品的重耍原料，甘草黄酮美白去斑效果显著，在未来化妆市场会有很大的发展前景。在消炎和抗变态作用上，甘草黄酮比磺胺和抗生素的药效要好，此外，甘草黄酮还有抗肿瘤、抗诱变等广泛的药理作用。近年来医药界对甘草中的黄酮类化合物兴起了研究热潮，新黄酮类化合物不断被研究发现。 2.2.3 多糖 在我国六、七十年

13、代仍没有关于甘草多糖及其药理作用的报道，直至 1986年史勇等方对甘草多糖对小鼠淋巴细胞的激活增殖效应，及其免疫学活性进行了报道。 近年来，植物中活性多糖受到人们的青睐，从甘草药材中也提取分离出一种活性多糖，其多糖由鼠李糖、葡 萄糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。药理作用初步研究显示甘草多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒作用、无细胞毒性。 2.2.4 其它 生物碱类成分在甘草属植物的研究中报道很少。胡金锋等首先从云南甘草的根茎中分离出一种新的生物碱成分，为吲哚类内盐型生物碱，命名为云甘定 (glyyunnanenine)。另外，高发奎等首次从甘草废渣提取物中鉴定出了具有生理活性的亚麻酸乙酯。 3 甘草酸

14、单铵盐 (MAG)的制备工艺研究现状 6 MAG=甘草酸单铵盐 图 1-4 从甘草酸中粗提甘草酸单铵盐流程图 图 1-5甘草酸单铵盐分子结构式 3.1 甘草酸的提取方法 甘草酸在植物体中可能以钾盐或钙盐的 形式存在。甘草酸盐易溶于水和稀氨水，加酸又可析出游离的甘草酸，故作为甘草酸的提取方法。 3.1.1 溶剂提取法 甘草酸为弱酸，骨架为齐墩果烷型，分子中含有多个羧基、羟基等极性基团，传统的水提法效率很低 10，所以经常采用极性很强的溶剂来强化提取，在极性溶剂中加入氨水，改甘草酸的提取 甘草酸的萃取 氨化得甘草酸三铵盐 酸化得甘草酸单铵盐 MAG 的纯化氨化得甘草酸三铵盐 7 变甘草酸的电离状态

15、，增加甘草酸的水溶性，提高对甘草酸的提取率。采用的手段有加热回流法、索式提取法、渗漉法、冷浸法等。热回流法是首选方法之一，由于其工艺成熟，目前工业中多采用此方法，该法是溶剂不断蒸发，然后经冷凝循环利用，能耗较高，对此法的技术改造一般集中在热能的循环利用方面。渗漉法和冷浸法是将样品装入适当的容器中，加入提取溶剂 (一般为水或稀醇 )浸提十多个小时，提取过程不需要加热。此方法适用于遇热易破坏、挥发的成分，也适合于含淀粉或粘液质多的成分，操作简单，但提取时间长，一般应用于实验室成分分析方面，此法虽然避免了高温带来的影响，但要达到较高的提取效率十分费时。索式提取法由于保持较高的浓度差，所以提取效率高，

16、杂质少，但提取时间长。 3.1.2 超声波辅助提取法 11 利用超声波辅助提取甘草酸，利用超声波的空化作用，对样品进行破坏，从而促进成分的提取，发现与传统的提取方法相比，超声 60min即可达到在较短时间内得到较高得率的目的。 3.1.3 微波辅助提取法 甘草酸为极性物质，易于吸收微波，在甘草内部产生热量，并将热量扩散到溶剂中，同时也将有效物质溶解到溶剂中。与传统方法相比，具有高效、快速、完全，节省时间、溶剂和能源等优点，但处理量小，仅适用于少量快速的提取 12。 3.1.4 超临界流体萃取 13 采用超临界流体萃取的方法提取甘草酸，根据甘草酸极性的特点，加入乙 醇、甲醇等改性剂，可明显促进甘

17、草酸的提取。 3.1.5 甘草酸提取最 新研究概况 14-15 2010年陈双华在甘草酸提取工艺优化文中指出微波提取法的提取率最高，索氏提取法次之，超声提取法较低。索氏提取法由于保持较高的浓度差，所以提取率较高，但提取时间长，溶剂用量大。比较超声提取与微波提取，超声提取时间长，功率消耗大。而微波提取热效率高，耗时短，提取率也较高，说明微波提取具有快速、节能的优势。通过比较确定微波提取法为甘草酸的最佳提取方法。同年，张小江等在甘草中甘草酸的提取工艺研究中表明低浓度氨水 ( 0. 1%和 0. 3% )溶液的提取率显著高于高浓度氨水 (0. 5% )溶液 ( P 0. 05 ) 。因此，此文作者认

18、为氨水的浓度不宜过高，从节约成本角度出发，建议选取 0. 1%氨水和 10%乙醇溶液作为提取甘草酸的溶媒。 8 3.2 甘草酸的溶解 该过程是将甘草酸粗提物用乙醇或丙酮等有机溶剂提取，保证一个含水量较小的环境，便于下一步的氨化，因甘草酸三铵盐易水解。吴安心等 16探索了乙醇一丙酮组成的二元溶剂系统，罗晨曲等口刀深入考察提取溶剂和温度对甘草酸收率的影响，发现 95乙醇 -汽油 (10:4)二元溶剂冷浸提取收率最高，克服了单一溶剂提取工艺的一些缺点。 3.3 甘草酸单铵盐的纯化 3.3.1 有机溶剂法 17 （ 1）将制得的 MAG放入 85乙醇中，加入适量活性炭回流一段时间，过滤后，冷却结晶，得

19、甘草酸单铵盐纯品。 （ 2）将制得的 MAG吸附在聚酰胺粉上，用含水乙醇洗脱，除去甘草酸同系物、甘草黄酮类化合物、鞣质等，制得高纯度甘草酸单铵盐。 3.3.2 制备高效液相法 18 采用 C柱 (10 300)，流动相为甲醇：水： 36醋酸 =65:28:7，流速为 l0ml min，检测波长为 252nm，将 MAG用流动相溶解后，进样，收集流分，结晶得制各样品，含量 98。 3.2 甘草酸单铵盐制取方法选择 19 由甘草酸精制高纯度甘草酸单铵盐的方法较多 ,有传统的丙酮提取法、乙醇提取法、离子交换树脂法和超滤法等。传统丙酮萃取法工艺简单 ,萃取出的成分相对简单 ,精制产品纯度基本上能达到要

20、求 ,但缺点有 :丙酮毒性大 ,提纯过程容易造成污染 ,对于要求较高的药用产品 ,不适合用它作萃取剂 ;丙酮能使蛋白变性 ,毒性大 ,萃取后残渣不易进行利用 ,只能抛弃 ,造成环境污染 ;丙酮沸点低 ,工业生产危险性大 ,采用安全措施比较困难 ;丙酮萃取后容易造成溶剂混合 ,回收溶剂困难 ,尤其是钾盐、钠盐采用钾碱醇液中和时 ,乙醇与丙酮混合在一起 ,给溶剂回收和再利用造成困难 ,影响产品质量。离子交换法一般用大孔树脂作吸附剂 ,用 10 %左右稀乙醇洗脱 ,该法缺点有 :吸附剂需用大量溶剂洗脱 ,洗脱后还需大量溶剂再生 ,低含量乙醇回收十分困难 ,回收率低 ;树脂吸附一次不易制备达到要求的产

21、品 ,需多次洗脱 ,或先用溶剂提纯到 90 %左右再洗脱 ,这样导至工艺设备复杂 ,而且不易进行工业化生产 ,故我们不予采用。超滤法设备要求较高 ,投资较大 ,而且也不容易大量生产。乙醇萃取法工艺简 单 ,不会造成溶剂混淆 ,溶剂回收再利用方便 ,且乙醇生产较安全 ,缺点是乙醇萃取物成分相对复杂 ,给后续精制工艺带来困难 ,但我们经过大量实验 ,选用一种沉淀剂 ,将部分杂质沉淀下来除去 ,这样解决了后续工艺问题 ,而增加的工艺过程与成本却不多 ,得率较高 ,产品质量稳定 ,是一种较先进且易于工业化的方法。我们用 26 %甘草酸作原料 ,用丙酮、无水乙醇、 95 %乙醇 3 种提取方法进行比较

22、,其结9 果 ,用丙酮、无水乙醇、 95 %乙醇萃取生产出甘草酸单铵盐均能达到 95 %以上 ,但 95 %乙醇生产出产品质量最稳定 ,无不合格产品 ,方差最小 ,平均 含量最高达 96.142 %。就得率方面来说 ,得率高低分别是 95 %乙醇、无水乙醇、丙酮 ;得率稳定性 :丙酮 95 %乙醇 无水乙醇。综合考虑其它因素 ,采用乙醇方法大大优于采用丙酮的传统萃取法 ,对于无水乙醇与 95 % 乙醇比较 , 虽然得率相差不大 (112 %) ,但得率及质量稳定性方面 ,95 %乙醇均优于无水乙醇 ,无水乙醇价格比 95 %乙醇高 ,回收后要进行脱水才能继续使用 ,因此生产成本比 95 %乙醇

23、高出许多 ,两者综合考虑 ,选用 95 %乙醇作为萃取剂是最合适的。 4 药理作用 中华人民共和国药典 2005年版 对甘草功能叙述为：甘草补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢孪急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。炙甘草补脾、益气、复脉。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心动悸，脉结代。经现代医药科学研究，甘草药理作用比较确定的有：肾上腺皮质激素样作用、抗炎及抗变态反应、抗消化系统溃疡、镇咳、抗菌、抗肿瘤、抗艾滋病等。临床常用于治疗胃、十二指肠溃疡、支气管哮喘、传染性肝炎、皮肤炎症等。 4.1 甘草酸及其衍生物的药理作用 20 4.1

24、.1 抗炎 Abe等 用甘草酸治疗感染了伴 7JN_球蛋白诱导的肝炎的小鼠发现，与空白对照组相比，甘草酸可以促进抗原肝树枝状细胞产生 interleukin(IL)-10，从而减轻炎症。含甘草酸的甘草提取物可以有效治疗过敏性皮炎如湿疹、瘙痒症和皮肤囊肿。 4.1.2 抗溃疡 甘草酸及其衍生物可以抗由布洛芬引起的大鼠胃溃疡。 4.1.3 抗病毒 甘草酸在临床上已被用于治疗慢性肝炎。甘草酸在体外可明显抑制 HIV阳性病人血单核细胞中 HIV复制。甘草酸还可以减少感染了致死剂量流感病毒的小鼠的发病率和死亡率。Cinatl等比较了三唑核苷 、 6-azauridine、菌酚酸、吡唑呋哺菌素和甘草酸对两

25、种 SARS冠状病毒 FFM一 1和 FFM-2的抑制，发现甘草酸对病毒复制的抑制最强。 4.1.4 抗癌 甘草酸可以通过调节 Th2细胞达到抑制 B16黑素瘤向肺部转移的效果。 Shiota等发现甘草酸可显著抑制二乙基亚硝胺 (NDEA)介导的肝细胞癌。 10 4.1.5 抑菌 当甘草甜素的浓度为 0.51时，可以完全抑制牙菌斑的形成。 4.1.6 免疫调节作用 甘草酸类具有非特异性免疫调节作用，主要是增强吞噬功能，还可选择性地增强辅助性T淋巴细胞的增殖能力和 活性。 4.2 甘草黄酮的功能作用 现代药理研究结果表明，甘草中黄酮类化合物具有较强的生理活性。自上世纪 60年代以来，人们就发现甘

26、草属植物中的黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、强心、镇静和镇痛等作用。后又发现它们有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用。尤其是近年来还发现甘草中黄酮类成分对艾滋病病毒 (HIV)有很强的抑制增殖作用，使甘草黄酮类化合物的研究和应用逐渐成为热点。 4.2.1 抗自由基、抗氧化作用 生物组织膜因产生过氧化作用而导致结构和功能损伤的自由基是引起癌症、衰老、心血管疾病的罪恶之源。生物体的常见自由基 有，超氧阴离子自由基 (O2 )、羟基自由基 ( OH)、烷氧自由基 (RO )等 .研究表明，甘草酮类物质能通过消除自由基或淬灭超氧自由基，终止自由基的连锁反应从而达到抗氧化作用。吴碧华等 21对甘草黄酮与维生素

27、E和甘露醇的抗氧化作用比较发现，甘草总黄酮具有明显清除氧自由基和羟自由基的能力，其中清除氧自由基的作用明显优于维生素；清除羟自由基具有较强的直接清除作用，该作用明显优于甘露醇。木合布力 .可布力孜等 22利用两种体 外抗氧化实验模型，对甘草总黄酮及其所含的主要异黄酮类成分甘草定的抗氧化活性进行研究，研究表明甘草总黄酮和其重要组分甘草定均有较强的抗氧化活性，其中甘草定的清除自由基活性与常用的自由基清除剂银杏黄酮类似。 甘草黄酮类物质可以防止低密度脂蛋白 (LDL)发生脂质过氧化反应，降低病人血浆中的低密度脂蛋白被氧化的易感系数，提高血浆中的低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝聚、抗滞留的能力，可以用来治疗各种由于血脂高、脂质氧化所引起的疾病。 Paulu A 等研究了甘草中异黄酮类化合物 glabridin 对 LDL 氧化过程的影响，证实其具 有较强的抗氧化作用。 4.2.2 抗肿瘤作用 甘草中黄酮类物质具有植物雌性激素活性，可以抑制一些癌细胞的增殖，例如异甘草素对前列腺癌细胞的增殖有明显的抑制作用，而光甘草定可以抑制胸腺癌细胞的增生。二甲基苯并蒽类甘草黄酮可以除去癌物质，从而起到预防癌症的功效。赵世元等研究发现甘草黄酮各组能显著抑 SElslsod,鼠体内肿瘤的发生和发展，能显著提高腹水瘤小鼠的生命延长率，并