光甘草定提纯研究[文献综述].doc

1、光甘草定的提取和提纯的研究 毕业论文 文献综述 生物工程 光甘草定提纯研究 1 前言 甘草为豆科植物甘草 (Glycyrrhiza uralensis Fisch)、胀果甘草 (Glycyrrhiza inflata Bat)或光果甘草 (Glycyrrhiza glabra L)的干燥根及根茎，是一种常用的重要中药 1。甘草中的活性成分主要包括 3类：三萜类 (以甘草甜素为主 )、黄酮类和多糖类。甘草黄酮类成分 (1icorice flavonoids)具有多种生理功能，如抗脂质过氧化、抑制多种肿瘤细胞的增殖、诱导凋亡等 2。光甘草定 ( Glabridin ,图 1)是光果甘草所特有的异黄

2、酮类成分，它不仅在光果甘草黄酮类成分中含量最高 (占 11 )，而且具有良好的药用开发价值。作为光果甘草中的主要脂溶性异黄酮，光甘草定主要留存在提取甘草水溶性成分后留下的甘草废渣中。在药理实验中，光甘草定显示出明显的抗氧化、保护神经细胞作用及一定的降血脂和降血压等作用 3-4，在心脑血管疾病的防治药物研究中亦显示出良好的前景。 O OO HO HH图 1 光甘草定的化学结构式 2 光甘草定的结构性质 光甘草定 (glabridin)微黄色粉末， mp.233.3 235.5 , 19 9.5 (c0.3,CHCl3);与 FeCl3反应显棕色。 TLC:Rf = 0.42( 展开剂 CH2Cl

3、29%/MeOH, Silica gel 60 F254) 。 UV max(EtOH)nm:230,282,322(sh)。 EI-MS m/z(rel. int.,% ):324(M+,31) , 309(M+-CH3,100),187(14), 173(52),136(8);分子式 C20H20O4 ,计算值 : C 74.06;H 6.21; 测定值 :C 74.24; H 6.27。 IR max (KBr)cm-1:3374,1620,1607,1596,1519。 1H NMR ( 400MHz,CDCl3) :7.68 (1H, br s,OH),7.48, 光甘草定的提取和提

4、纯的研究 (1H,brs,OH),6.91 (1H,d,J = 8.2 Hz, 6 -H) 6.81 (1H,d,J = 8.2 Hz,5-H),6.64 (1H,d,J = 9.9 Hz,4-H) 6.46 (1H,d,J = 2.2 Hz, 3 -H),6.39 (1H, d,J = 8.2Hz, 2.2,5 -H),6.33(1H,d,J = 8.2 Hz,6-H) , 5.55 (1H,d,J = 9.9 Hz, 3 -H) , 4.39 (1H,dd,J = 1.8, 3.2,10.3 Hz, 2-H) ,4.01 (1H,ddd,J = 10.3,10.3 Hz,2-H) ,3.5

5、2 ( 1H,m,3-H) ,2.99(1H,dd,J = 11.0, 15.7Hz,4-H) ,2.83 (1H,m, 4-H) , 1.42, 1.40 (3H each,s,5 -and6 -CH3)5。 3 光甘草定的分离和提纯 3.1 光果甘草总提取物的制备 6 取光果甘草 50g，研碎，分别用丙酮提取 3次，合并 3次提取液，减压蒸馏回收丙酮，得黄褐色浸膏 2g(总提取物 )，提取分离工艺见图 2。 3.2 柱层析法分离 3.2.1 Al2O3柱层析分离 将氧化铝置于玻璃层析柱内 (2 cm 30 cm，上柱高度为 15cm)甲醇浸泡 24h。将总提取物与少量 Al2O3混合，加入

6、 Al2O3层析柱后，采用浓度梯度法 (分别用 CH2Cl2、 CH2Cl2 MeOH 2.5%、 CH2C12 MeOH 5%、 CH2Cl2 MeOH 10%、 CH2Cl2 MeOH 40%)进行洗脱。因 Al2O3极性大而能吸附极性大的成分，而通过洗脱可得到极性小和极性中等的组分。因光甘草定的极性中等而留在极性中等的组分中 (组分 )。 3.2.2 硅胶柱层析分离 将组分用硅胶层析柱进行分离 (2cm20cm，上柱高度 15cm)，分离成 (A)、 (B)和 (C)3个组分；洗脱液浓度分别为： CH2Cl2、 CH2Cl2 MeOH (100： 2.5)、 CH2Cl2 MeOH(20

7、：1)、 CH2Cl2 MeOH(10:1)、 CH2Cl2 MeOH(5:2)。 3.3 制备型薄层板分离 将组分 (C)用制备型薄层板进行进一步分离 (CH2C12 MeOH 9%)，收集 Rf值为 0.42的色带，并用丙酮提取，减压蒸干。用苯环己烷混合溶剂重结晶，得光甘草定纯品。分离过程中，光甘草定用简单的 TLC法进行监测跟踪 (硅胶 GF254薄板，展开剂为 9%甲醇 CH2Cl2)。用紫外灯观察并记录斑点的 Rf值 (光甘 草定的 Rf值为 0.42)。 甘草（ 50克） 丙酮提取，过滤，减压浓缩 丙酮提取物 (提取物 I) 氯仿 -盐酸萃取 光甘草定的提取和提纯的研究 无机溶剂

8、有机溶剂 沉淀 减压蒸干 甲醇 -环己烷提取 甲醇液 提取物 环己烷液 提取物 上氧化铝层析柱 组分（极性小） 组分（极性 中等） (提取物 III) 上硅胶柱 组分 a 组分 b 组分 c 制备型 TLC分离 苯 /环己烷重结晶 Glabridin 图 2 光甘草定的提取分离流程图 3.4 光甘草定的制备工艺改进 7 利用 3种方法对光果甘草总黄酮粗提物进行制备，并比较提取效果。 (1)取甘草根粉末 lkg，用二氯甲烷回流提取 3次，合并 3次提取液，减压浓缩至干，得棕色浸膏 25g(提取物 )。 (2)取甘草根粉末 lkg，用 95 甲醇回流提取 3次，合并 3次提取液 ，减压浓缩至干，得

9、棕色浸膏 45g(提取物 )。 (3)取甘草根粉末 lkg，用 95 乙醇回流提取 3次，合并 3次提取液，减压浓缩至干，得棕色浸膏 48g(提取物 )。 取 2g提取物 I，装载硅胶层析拄，以 CH2C12 MeOH(9： 1)为洗脱液进行分离，得到 6个组分。其中组分 5具有光甘草定的特征 (硅胶薄层 Rf值为 0 42)。将组分 5用制备型薄层板进行分离 (展开剂为 CH2C12 MeOH一 91： 9)，收集 Rf值为 0 42的色带，并用丙酮提取，减压浓缩至干，用甲苯环己烷混合溶剂 (3： 1)进行重结晶，得 Glabridin纯品。 按文献方法对光甘草定 3种粗提物中的光甘草定含量

10、进行测定，对光果甘草中光甘草定的提取率进行考察，再利用硅胶柱层析和制备薄层层析法对光甘草定进行分离纯化结果见表1。 光甘草定含量（ %） 出膏率（ %） 提取溶剂 提取量（ g） 光甘草定的提取和提纯的研究 提取物 2.9 2.5 二氯甲烷 0.725 提取物 2.6 4.5 95%甲醇 1.170 提取物 2.3 4.8 95%乙醇 1.104 表 1 3种光果甘草粗提物中光甘草定的百分含量 表 1中的数据显示，利用二氯甲烷提取得到的提取物中光甘草定的百分 含量较高 (达2.9%)，但利用此法时光甘草定的提取量小，即从 lkg甘草中可获得 0.725g光甘草定；利用甲醇提取得到的提取物中，虽

11、然光甘草定的含量稍低 (2.6%)，但光甘草定的提取量较大(1.170g/1kg甘草 )，即提取较彻底；利用乙醇提取时，效果与甲醇提取的类似。考虑到环保和安全等问题 (如甲醇的毒性和二氯甲烷对环境的污染 )，建议利用乙醇提取法更适合于工业化生产光甘草定提取物。 该方法分别利用二氯甲烷、甲醇和乙醇等 3种溶剂提取法，对光果甘草中光甘草定的提取率进行考察；再利用硅胶柱层析和制备薄层层析法对光 甘草定进行分离纯化，对文献工艺进行简化。利用 3种不同提取方法获得的光果甘草总黄酮粗提物中，用乙醇提取光果甘草总提取物具有提取率高、安全和环保等优点；利用硅胶柱层析法对粗提取物中的不同极性组分进行分离、再利用

12、制备薄层法进行分离纯化，在快速制备高纯度的光甘草定中具有一定参考价值，此方法比文献工艺简便易行。 3.5 光甘草定的检测方法 采用高效液相色谱法检测光甘草定的含量。检测条件如下 8，色谱柱： SymmetryC18反相色谱柱 (5 m， 4.6 mm250 mm)， 流动相：乙腈 -水 -冰醋酸 (55： 44： 1)，柱温 30，检测波长 282nm，进样量 10 L。光甘草定在 0.09 0.45 mg mL 内呈良好线性关系 (r=0 999 7)，平均回收率 100.2， RSD为 0.89。反相高效液相色谱法简便、快速、重复性好，适用于光果甘草中光甘草定的含量测定。 a对照品为光甘草

13、定对照品 (购于成都普思生物科技有限公司，纯度为 99.07。而 b样品则为实验室分离得到，纯度为 85%以上。利用硅胶柱层析，洗脱液梯度分别为： CHCl3、 CHCl3 MeOH(300： 1)、 CHCl3 MeOH(100： 1)、 CHCl3 MeOH(50： 1)、 MeOH，硅胶薄层板跟踪点板。最后合并含有光甘草定的馏分，利用高效液相色谱仪检测纯度。在上述的测量条件下，对照品和样品的 HPLC液相图谱见图 2。 光甘草定的提取和提纯的研究 图 2 光甘草定对照品及样品 HPLC液相图谱 4 光甘草定的应用前景 光甘草定（ Glabridin）的生物活性和药理作用研究目前成为天然黄

14、酮类化合物研究中的一个热点。 9 4.1 抗氧化作用 Glabridin的化学结构具有异黄酮母核， A环和 B环为芳环， B环上有 2个酚羟基 ， C9-位上有个烯键。因此， Glabridin具有较强的抗氧化活性。 Vaya等经 AAPH(2,2-盐酸脒基丙烷 )介导的自由基氧化系统中观察 Glabridin对 LDL被自由基氧化的保护作用，结果发现 Glabridin可有效地阻止 LDL氧化变质，以 4O-60mol L的浓度抑制 LDL的氧化率为 90%。 光甘草定的提取和提纯的研究 4.2抗动脉粥样硬化和降血脂作用 光果甘草提取物及 Glabridin以明显强的抗氧化能力阻止低密度脂蛋

15、白的氧化变质，从而防止动脉粥样硬化症的发生和发展。 Aoki等 10 观察含 Glabridin的甘 草黄酮油 (Licorice flavonoid oil， LFO)对人体的保健作用和安全性，发现 LFO1200 mg d的剂量对人体是安全的，并具有防治动脉粥样硬化等功效。 4.3神经保护和增强记忆作用 Yu等 11经体内外药理实验，研究 Glabridin对大脑巾动脉闭塞性脑损伤及星形孢菌素诱导损害的人鼠皮层神经元的保护能力。结果发现， Glabridin以 25 mg kg剂量在两种试验模型中，通过明显降低脑内 MDA浓度和增强内原性抗氧化剂 SOD和 GSH 的活性，显著减轻脑损伤程

16、度，并抑制星形孢菌素 诱导的大鼠皮层神经元损伤。 Glabridin对脑细胞的以上保护作用具有剂量依赖性特点。 4.4雌激素样活性 Glabridin具有类似雌激素的结构特点，能产生雌激素样活性。 Snait等 12经动物实验研究发现， Glabridin作为一种植物性雌激素，能够进入予富细胞内的雌激素受体，产生类似雌激素的生物活性，其以 2.5 25mg每只老鼠的剂量所产生的雌激素活性强度与 5 mg每只动物的雌二醇相当。 4.5抑制黑色素形成作用 Yokota等 13观察 Glabridin在 B16黑色素瘤小 鼠体内对黑色素细胞形成和炎症发生以及对豚鼠皮肤的影响。结果发现， Glabri

17、din以 0.1 1.0 g ml的浓度显著抑制酪氨酸酶的两种亚型一 T1和 T3 tyrosinase的活性，并产生显著的抗炎作用，对皮肤产生明显的增白效果，从而在化妆品领域内显示良好的应用价值。现 Glabridin已成为许多高级化妆品的主要增白成分。 4.6减肥作用 Aoki14等对含 Glabridin的甘草黄酮油 (LFO， 1.2%的甘草黄酮与甘油三酯混合而成 )对肥胖老鼠的减肥效果进行实验研究，结果发现 LFO经 8周用药后，明显减 少腹部堆积的白色脂肪含量。 4.7其他药理作用 Jong等 15研究发现， Glabridin对于在脐静脉内皮细胞内肿瘤坏死因子 (TNF a)刺激

18、所光甘草定的提取和提纯的研究 引起的细胞间粘附分子 -1(Intercellular adhesion molecule-1， IcAM-1)的表达产生抑制作用。 Fukai等 16在患有肾小球疾病的小鼠模型巾，观察 Glabridin对血象的影响，通过以 3O mg kg d的剂量 10d给药治疗发现，用 Glabridin治疗组对蛋白尿的降低率 (47 4)mg/d明显高于对照组 (100 23)mg/d，即 Glabridin对肾炎有治疗作用。 Glabridin通过抑制细胞色素 P450家族中的有关氧化代谢酶的活性，对有些致癌物的激活有抑制作用 17。 此外，光甘草定还具有抗炎、抗溃疡

19、及抗菌等作用 ,应用前景广阔。赵全民等 18-19选取传统中药甘草提取光甘草定，通过 MABA药物敏感性实验方法研究其对结核分枝杆菌 H37Rv和 H37Ra的体外抗菌活性，并通过 NCCLS标准方法测定了光甘草定对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度 (MIC)。结果表明单体化合物光甘草定对 结核分枝杆菌有很好的抗菌活性，最低抑茵浓度均为 25 g/ml；光甘草定对实验中检测的金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和大肠杆菌也有抗菌活性，并且对革兰氏阳性杆菌的抗菌活性高于革兰氏阴性杆菌。 5 总结 Glabridin的抗氧化、降血脂、抗炎等作用在阻止心血管疾病的病理基础， LDL脂蛋白的氧化、

20、血管内皮细胞被炎症因子损伤和高脂血症等方面具有重要意义，这使 Glabridin在人类疑难症 -心血管疾病的有效药物干预中将拥有重要研究价值； Glabridin的抗脑损伤、保护神经细胞和提高认知能力等生物活性使它在老年痴 呆症的创新药物研究中显示较好的研究潜力； Glabridin的抑制酪氨酸酶和抗炎活性使它在化妆品 20原料研究开发中体现重要价值。 Glabridin是光果甘草所特有的一种黄酮类活性成分。光果甘草主要分布在我国西部地区，资源丰富，有野生和人工栽培基地，储备量较大。 Glahridin是在光果甘草精制总黄酮中含量最高的成分，约占 11%，有较好的开发应用价值。光甘草定被广泛应

21、用于化妆品、食品药品等行业，药理活性和经济价值越来越受到重视，而现有研究光甘草定提取工艺条件的文献很少，因此有必要对光甘草定的提取最佳工艺 条件做更深入的研究，并有很良好的应用发展前景。 参考文献 1 国家药典委员会中国药典 (一部 )S北京：中国化学工业出版社， 2005： 59-60 2 傅乃武，刘朝阳，张如意甘草黄酮体抗促癌、抗致突和氧化作用的研究 J 天然产物光甘草定的提取和提纯的研究 的研究与开发， 1995， 7(4)： 29 3 KUNTZ S， WENZEL U， DANIEL H Comparative analysis of the effects of flavonoid

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