人生长激素释放肽ghrelinGHRP-Ghrelin酶联免疫分析.DOC

1、人生长激素释放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中人生长激素释放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)含量。实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人生长激素释放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)水平。用纯化的人生长激素释放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入生长激素释放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)，再与HRP 标记的生长激素释放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)抗体

2、结合，形成抗体- 抗原- 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的生长激素释放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），通过标准曲线计算样品中人生长激素释放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)浓度。试剂盒组成：试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存说明书 1 份 1 份 封板膜 2 片(48) 2 片(96) 密封袋 1 个 1 个 酶标包被板 148 196 2-8保存标准品 0.5ml1 瓶 0.5ml1 瓶

3、2-8保存标准品稀释液 1.5ml1 瓶 1.5ml1 瓶 2-8保存酶标试剂 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8保存样品稀释液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8保存显色剂 A 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8保存显色剂 B 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8保存终止液 3ml1 瓶 6ml1 瓶 2-8保存浓缩洗涤液 (20ml20 倍)1 瓶 (20ml30 倍) 1 瓶 2-8保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20 分钟，离心20 分钟左右（2000-3000 转/ 分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2.血浆：应根据标本的

4、要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3.尿液：用无菌管收集，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左右

5、（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。操作步骤：1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分

6、别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50l 弃掉，再各取50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul ，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50l，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于

7、酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置37温育30 分钟。4. 配液：将30（48T 的20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T 的20 倍）倍稀释后备用。5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀， 37避光显色15分钟.10. 终止：每孔加终止液50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量

8、各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后15 分钟以内进行。注意事项：1 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔第一孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（n5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6 底物请避光保存。7 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9 本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8。2有效期：6 个月