大孔吸附树脂分离纯化猪毛菜总黄酮及其抗氧化活性.DOC

1、Comment jxhg_lcy1: 这是什么单位？请核对。下同。非常感谢您提出的疑问！ BV指树脂柱内装载树脂的体积（Bed volume)，简称 BV，文中已对 BV进行了简单的解释，谢谢您！大孔吸附树脂分离纯化猪毛菜总黄酮及其抗氧化活性王沙沙, 刘洋, 牛真真, 公衍玲 *(青岛科技大学化工学院药学系，山东 青岛 266042)摘要：采用不同大孔吸附树脂分离纯化猪毛菜总黄酮，并对纯化后的总黄酮进行体外抗氧化活性测试。通过考察影响树脂静态和动态吸附与洗脱的主要因素，确定猪毛菜总黄酮分离纯化优化工艺条件。静态吸附实验表明，AB-8 树脂分离纯化效果较好并且吸附符合 Langmuir和 Fre

2、undlich方程。动态吸附和解吸的最佳工艺条件为：上样液质量浓度 1.25g/L、pH=4.5、上样流速 2mL/min、上样量 2.5BV(BV指树脂柱内装载树脂的体积)、洗脱剂为体积分数 80%乙醇、洗脱流速 1mL/min，洗脱剂用量 4BV。所得洗脱液中黄酮质量分数从 10.20%增加到 51.89%，回收率为 84.43%。体外实验表明，纯化后的黄酮可以清除羟自由基和超氧阴离子自由基并有较好的还原力。纯化后的黄酮可以作为一种潜在的天然抗氧化剂。关键词：猪毛菜；总黄酮；大孔吸附树脂；纯化；抗氧化活性中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：Separation and Pu

3、rification of Total Flavonoids from Salsola collina with Macroporous Resins and Evaluation of Antioxidant ActivitiesWANG Sha-sha, LIU Yang, NIU Zhen-zhen, GONG Yan-ling*1(Department of Pharmacy, College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)Abst

4、ract:Separation and purification of total flavonoids from Salsola collina using macroporous resins and the antioxidant activities in vitro of purified flavonoids were studied. Critical factors that influence the static and dynamic adsorption and desorption of total flavonoids were selected and optim

5、ized. The static tests indicated that AB-8 resin was appropriate and its adsorption data were well fitted to the Langmuir and Freundlich isotherms. The optimal conditions for dynamic adsorption and desorption were sample concentration of 1.25g/L, pH4.5, flow rate of 2mL/min, sample loading amount of

6、 2.5BV(Bed Volume), and complete desorption with 4BV of 80% ethanol at 1mL/min. After the optimized purification, the purity of flavonoids was improved from 10.20% to 51.89%, and the recovery yield was 84.43%. The antioxidant tests revealed that the purified avonoids could scavenge hydroxyl and oxyg

7、en radicals and possessed strong reducing power. The results have demonstrated that the purified avonoids from Salsola collina can be used as a potential source of natural antioxidant.Key words:Salsola collina; total flavonoids; macroporous resins; purification; antioxidant activities收稿日期：2017-3-21基

8、金项目：国家自然科学基金青年基金(81300281)；山东省高校科技计划项目 (J15LK12)作者简介：王沙沙（1993-），女，硕士生。联系人：公衍玲（ 1975-），女，副教授，博士，E-mail: hanyu_。Comment jxhg_lcy2: 同时给出其中文名称您好，非常感谢您提出的宝贵意见，文中已添加中文名称，谢谢您！Comment jxhg_lcy3: 怎样脱脂的？您好！文中前一句提到是用石油醚进行脱脂的，谢谢您！Comment jxhg_lcy4: 给出参考文献。非常感谢您的意见。文中已对亚硝酸钠-硝酸铝比色法添加了参考文献。Foundation item:National

9、 Natural Science Foundation of China (Grant No.81300281); Shandong Province Higher Educational Science and Technology Program (Grant No.J15LK12)猪毛菜，是藜科植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)的全草，广泛分布于中国各地区，在民间一直用来治疗高血压、头痛、眩晕等疾病 1。在俄罗斯，猪毛菜是肝脏保护剂，是保健食品 Hearon(赫龙) 的主要成分之一，用来缓解酒精、药物及各种毒素引起的肝部不适 2。它的主要成分为黄酮、生物碱、糖类、有

10、机酸和甾醇等 3-5，其中黄酮和生物碱是其主要活性成分。而黄酮类化合物是自然界中存在的一种天然化合物，具有抗氧化 6、抗菌 7、抗癌 8、降血糖降血脂 9等作用。吴树国 10等以乙醇为提取剂，采用超声波法提取猪毛菜根茎中的黄酮类化合物，王晓静 11等利用聚酰胺树脂吸附洗脱技术提取和分离猪毛菜中的总黄酮。但超声提取对容器壁的厚薄及容器放置要求较高，否则会影响药材的浸出效果，还不适用于大规模生产，聚酰胺树脂虽然适合分离黄酮类化合物，但流速通常较慢，导致实验的循环周期较长。因此，有必要寻找一种高效且低廉的技术来对猪毛菜中总黄酮进行提取和纯化。大孔吸附树脂因其成本低、选择性好，吸附量大、再生处理方便等

11、优点 12，近年来被广泛用于中草药活性成分的研究 13-15，但目前国内外尚未有大孔树脂纯化猪毛菜总黄酮的报道。本文选用不同型号的大孔吸附树脂分离纯化猪毛菜总黄酮，通过静态与动态实验考察了猪毛菜总黄酮的分离纯化工艺，并评价了黄酮的抗氧化活性，旨在为猪毛菜资源的开发应用提供理论依据。1 实验部分1.1 材料、试剂与仪器猪毛菜购自河北祁州药材堂，经青岛科技大学中药学金宏副教授鉴定为藜科植物猪毛菜的干燥全草；芦丁对照品，成都曼斯特生物科技有限公司；大孔吸附树脂 HPD-100、D101、X-5、AB-8、ADS-17 ，ADS-7，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；大孔吸附树脂 NKA-9、 S-8，郑

12、州勤实科技有限公司；其它试剂均为市售 AR。UV-1801型紫外/可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司；RE-52A 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；GZX-9240MBE 数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司； SHA-CA数显恒温水浴振荡器，常州赛普实验仪器厂；D2F-6051 型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；BT00-100M 恒流泵，保定兰格恒流泵有限公司。1.2 方法1.2.1 猪毛菜总黄酮粗提物的制备猪毛菜用蒸馏水洗净后置于烘箱中 60烘干，粉碎，过 14目筛。用石油醚脱脂，自然风干，然后取脱脂猪毛菜 100g，用 2L 体积分数为 60%的乙醇在 100条件下回流提取

13、2次，每次 2h。合并滤液，减压浓缩，8000r/min 离心 10min，取上清液，置于冰箱 4保存。1.2.2 总黄酮含量的测定以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法 16测定猪毛菜总黄酮的含量。以芦丁质量浓度 C（g/L）为横坐标、吸光度 A为纵坐标，绘制标准曲线方程为：A=15.179C-Comment jxhg_lcy5: 指谁？您好，“其”是指的各树脂，已在文中进行了修改，谢谢！Comment jxhg_lcy6: 二者的单位呢？您好，吸附率和解吸率均是指百分率，已在文中添加了%号，谢谢！0.0274（C：质量浓度 g/L；A ：吸光度；相关系数：R 2=0.9998），根据回

14、归方程测定样品中总黄酮的质量浓度。1.2.3 树脂的预处理参考文献 17，对大孔吸附树脂进行预处理，并将其用蒸馏水浸泡备用。1.2.4 静态吸附和解吸实验1.2.4.1 树脂筛选及静态吸附过程精密称取预处理好的树脂 2g，加入 50mL 0.62g/L的猪毛菜黄酮粗提液，在 25恒温振荡 24h，振荡频率 130r/min。待其吸附平衡后，用 50mL 体积分数为 70%的乙醇溶液进行洗脱，25恒温振荡 24h，测定解吸液中黄酮的质量浓度 18。根据下式计算各树脂的吸附量、吸附率和解吸率。 WV)C(Qie0e1E%)0)(Died式中：Q e表示吸附量(mg/g) ；C 0、C e和 Cd分

15、别代表吸附液初始质量浓度、平衡质量浓度和洗脱液质量浓度(g/L)；V i和 Vd分别表示吸附液体积和洗脱液体积(mL)；W 表示树脂质量(m)；E 表示吸附率 (%)； D表示解吸率(%) 。1.2.4.2 静态吸附动力学实验取筛选的大孔吸附树脂 2g，精密加入 50mL 0.62g/L的猪毛菜黄酮粗提液，在 25恒温振荡 8h，每 1h各取 1mL，测定总黄酮质量浓度，绘制静态吸附动力学曲线 19。1.2.4.3 AB-8树脂吸附等温线精密称取 AB-8树脂 2g，加入 50mL不同浓度的猪毛菜黄酮粗提液，分别在 25、35、45恒温振荡 24h，测定总黄酮质量浓度，采用 Langmuir和

16、 Freundlich两个吸附模型考察吸附过程 20。Langmuir方程: eLmeCK1QFreundlich方程: nF式中：Q e表示吸附量(mg/g) ；C e表示平衡质量浓度(g/L) ；Q m表示最大吸附量(mg/g)；KL表示 Langmuir常数；K F和 1/n表示 Freundlich常数。1.2.5 动态吸附和解吸实验将预处理好的 AB-8树脂湿法装入 16mm40cm的玻璃层析柱中，然后将猪毛菜黄酮粗提液上柱，待样品溶液全部通过树脂柱后，用蒸馏水洗至流出液无色，然后用乙醇溶液洗脱，收集洗脱液。通过测定总黄酮含量，考察上样液 pH值、上样流速、上样量以及洗脱剂浓度、洗脱

17、流速及洗脱剂用量等各因素对树脂性能的影响，确定最佳工艺参数。1.2.6 验证实验Comment jxhg_lcy7: 表 1中的粒径、比表面积、平均孔径数据是你测的？还是来自于文献，如果来自于文献，请分别给出参考文献。如果是你测的请给出实验方法。您好，对于粒径、比表面积、平均孔径等性能指标是买树脂时商家说明书上提供的，谢谢！取 AB-8树脂 3份，根据上述优化实验的结果，采用最佳工艺条件分离纯化猪毛菜总黄酮。对洗脱液进行干燥、称重，验证其总黄酮含量。1.2.7 体外抗氧化活性测定1.3.7.1 羟基自由基清除率的测定采用 Fenton法 21对纯化总黄酮的羟基自由基清除活性进行测定，在 510

18、nm波长下测定样品的吸光度。抗坏血酸为阳性对照，实验测定 3次取平均值。羟基自由基清除活性按下式计算：羟基自由基清除百分比/%=A 0-(Ai-Aj)/A0100式中：A 0表示空白样液的吸光度； Ai表示不同浓度样品液的吸光度；A j表示不加水杨酸时样液的吸光度。1.3.7.2 超氧阴离子自由基清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法 22测定纯化总黄酮的氧自由基清除活性，在 325nm处测吸光度，每隔 0.5min测定一次，共测定 5min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。抗坏血酸为阳性对照，实验测定 3次取平均值。氧自由基清除活性按下式计算：氧自由基清除百分率 /%=(V0-Vs)/V010

19、0式中：V 0是空白管的吸光度； Vs是样品管的吸光度。1.3.7.3 还原力的测定采用铁氰化钾还原法 23测定其还原力，在 700nm处测定吸光度值。实验测定 3次取平均值。2 结果与讨论2.1 静态吸附与解吸实验2.1.1树脂类型的筛选为筛选出适合纯化猪毛菜总黄酮的最佳树脂，本实验采用 8种不同型号的大孔吸附树脂对猪毛菜粗提液进行处理，以树脂的静态吸附量和解吸率为指标，比较不同型号树脂的吸附特性，结果见表 1。表 1 8种大孔吸附树脂的性能指标及吸附率与解吸率Table 1 Physical and static adsorption-desorption properties of 8

20、resins型号 极性 粒径(mm) 比表面积 (m2/g) 平均孔径 (nm) 吸附量(mg/g) 吸附率(%) 解吸率(%)AB-8 弱极性 0.31.25 480520 1314 12.61 81.34 90.72D101 非极性 0.31.25 500550 910 12.24 78.96 84.32HPD-100 非极性 0.31.2 650700 8.59 11.27 72.68 82.54NKA-9 极性 0.31.25 250290 15.516.5 11.83 76.35 70.63S-8 极性 0.31.25 100120 2830 11.14 71.86 35.82X-5

21、 非极性 0.31.25 500600 2930 10.69 68.94 80.04ADS-17 中极性 0.31.25 90150 2530 11.66 76.23 41.95ADS-7 强极性 0.31.25 100 2530 10.93 70.52 45.68由表 1可以看出，不同类型树脂对猪毛菜总黄酮的吸附和解吸性能不同，其中 AB-8Comment jxhg_lcy8: 是降低还是增加？您好，非常感谢您提出的疑问，吸附量是增加的。文中的纵坐标是溶液中总黄酮的浓度（Ce ），根据2.4.1下的公式可知，总黄酮的浓度降低，吸附量增加，所以文中写了树脂在 1h内吸附量是迅速增加的，谢谢您！

22、Comment jxhg_lcy9: 是优于还是差于？您好，AB-8 树脂的吸附率是优于D101的，因为 AB-8树脂使总黄酮的浓度下降的快，代表吸附的快，所以 AB-8树脂的效果是较好的，谢谢您！Comment jxhg_lcy10: 图 2中根本没有 1.25g/L时的数据，请核对。您好，非常感谢您提出的疑问！1.25g/mL是样品液的初始浓度Co，图 2的横坐标是平衡时的浓度Ce，图 2的第 4个点代表的平衡浓度就对应初始浓度 1.25g/L（图中5个点的横坐标对应的初始浓度分别为0.5、0.75 、1.0、1.25、1.5g/L) 。我们查阅了大量英文文献，吸附等温线的折线图均是以平衡

23、浓度为横坐标，每个平衡浓度有对应的初始浓度。因此我们已在文中修改为当对应的样品液初始浓度为 1.25g/L时，吸附量最大，谢谢您！Comment jxhg_lcy11: 谁的？您好，由表 2可知，0.157 为 25时的 1/n，已在文中修改为 25时 1/n为 0.157，谢谢！树脂吸附量最大，吸附率可达 81.34%；X-5 的吸附量最小，吸附率仅为 68.94%。这主要与树脂的结构、极性、比表面积及孔径有关。S-8、ADS-17 和 ADS-7因其比表面积小，解吸率均较低。综合考虑树脂的饱和吸附量和解吸性能，优选出 AB-8和 D101两种树脂。2.1.2 吸附动力学曲线使用 AB-8和

24、 D101树脂分离纯化猪毛菜总黄酮，测定其吸附动力学曲线。由图 1可知，2种树脂在 1h内吸附量迅速增加，然后缓慢上升，并在 4h达到平衡。但从总体上看，AB-8树脂的吸附率始终优于 D101。因此，选择 AB-8树脂进行后续测试。0 2 4 6 800.10.20.30.40.50.60.7AB-8D101Time/hConcentration(g/L)图 1 静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption kinetic curves of flavonoids on AB-8 and D101 resins2.1.3 吸附等温线不同温度下 AB-8树脂的吸附等温线见图

25、2，由结果可知，随着初始样品浓度的增加，吸附量也增加。当对应的样品液初始浓度为 1.25g/L时，吸附量最大。因此，选择样品液初始浓度为 1.25g/L进行实验。另外，分别用 Langmuir和 Freundlich模型对实验数据进行拟合，结果如表 2所示。由表 2可知，Langmuir 和 Freundlich模型的相关系数均较高，表明吸附过程是单分子层吸附，并且在 25时相关系数最高，分别为 0.9976和 0.9955，这说明 AB-8树脂对总黄酮具有较好的吸附。一般来说，在 Freundlich模型中，1/n 在 0.1到 0.5之间，吸附容易发生，如果1/n大于 1，吸附较难发生 2

26、4。由表 2可知，25时 1/n为 0.157，表明 AB-8树脂对总黄酮的吸附很容易发生。因此，AB-8 树脂适合分离纯化猪毛菜总黄酮。Comment jxhg_lcy12: 横坐标单位改为 g/L的形式，下同。您好，非常感谢您的建议，文中出现的 mg/mL均已改成 g/L，谢谢您！Comment jxhg_lcy13: 纵坐标为什么不用 Qe表示了，请全文统一，下同。您好，图中横坐标已统一为Adsorption capacity，谢谢您！0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.645678910 253545Absorption equilibrium concentration(

27、g/L)Adsorptioncapacity(mg/g)图 2 不同温度下总黄酮的吸附等温线Fig.2 Adsorption isotherm of total flavonoids on AB-8 resin at 25,35,45表 2 不同温度下 Langmuir和 Freundlich吸附等温式Table 2 Langmuir and Freundlich parameters of total falvonoids on AB-8 resin at different temperatureTemperature() Langmuir equation R2 Qm Freundlic

28、h equation R2 1/n25 Ce/Qe=0.1083Ce+0.0016 0.9976 9.23 Qe=10.58Ce0.157 0.9955 0.15735 Ce/Qe=0.1122Ce+0.0017 0.9974 8.91 Qe=9.93Ce0.145 0.9928 0.14545 Ce/Qe=0.1163Ce+0.0019 0.9973 8.60 Qe=9.31Ce0.136 0.9843 0.1362.2 动态吸附和解吸实验2.2.1 样品液 pH对黄酮动态吸附的影响取 5份猪毛菜黄酮提取液分别调成 pH=3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，将 3BV质量浓度为1.25g

29、/L的上样液以 2mL/min的流速上样，按 1.3.5节方法进行动态吸附实验，考察不同pH值对吸附量的影响，结果见图 3。由图 3可知，当 pH值为 4.5时，总黄酮的吸附量最高，吸附量可达 8.50g/L；当 pH大于 4.5时，吸附量反而降低。这是由于黄酮类化合物具有多羟基酚结构和糖苷键，呈弱酸性，因此在弱酸性条件下能够达到较好的吸附效果 25。因此，选择样品液 pH值为 4.5。4 6 86.577.588.59pHAdsorptioncapacity(mg/g)图 3 pH值对吸附量的影响Fig.3 Effect of pH on adsorption capacity of AB-

30、8 resin2.2.2 上样流速对黄酮动态吸附的影响在上样液 pH=4.5、上样质量浓度 1.25g/L 和上样体积 3BV 的条件下，考察了不同上样流速对总黄酮吸附量的影响，结果见图 4。由图 4 可知，随着吸附流速的增加，吸附量降低。这是由于上样流速过快，黄酮溶液与树脂的接触时间短，溶液里的分子来不及扩散到树脂的内表面，导致吸附率下降。上样流速较小时，黄酮分子有足够的时间与树脂内表面充分接触，有利于黄酮溶液的吸附。但流速 2mL/min 与 1mL/min 相比，吸附量相差不大，因此考虑到效率，将吸附流速选择为 2mL/min。1 2 3 4 577.37.67.98.28.58.8Sa

31、mple loading flow rate(mL/min)Adsoptioncapacity(mg/g)图 4 上样流速对吸附量的影响Fig.4 Effect of sample loading flow rate on adsorption capacity of AB-8 resin2.2.3 动态泄露曲线取 pH=4.5、质量浓度为 1.25g/L 的猪毛菜黄酮提取液，以 2mL/min 的流速通过树脂柱，每 1BV 柱体积收集流出液，以流出液柱床体积为横坐标，流出液黄酮质量浓度为纵坐标绘制吸附泄露曲线，结果见图 5。一般情况下流出液的目标物质量浓度达到上样液目标质量浓度的 1/10

32、时，认为达到了目标物的泄漏点 26。如图 5 可知，AB-8 树脂对猪毛菜总黄酮有较好的吸附性能，泄露点为 2.5BV 左右，所以选择上样量为 2.5BV。1 2 3 4 5 600.10.20.30.40.50.60.7Sample loading amount/BVConcentrationoftotalflavonoids(g/L)图 5 动态泄露曲线Fig.5 Leakage curve for the adsorption of AB-8 resin2.2.4 乙醇体积分数对洗脱效果的影响Comment jxhg_lcy14: 此处给出最佳条件的具体数据。您好，文中已添加最佳条件的具

33、体数据，谢谢您！Comment jxhg_lcy15: 给出具体数值您好，具体数值已添加，谢谢您！Comment jxhg_lcy16: 同批注 22.您好，论文中已添加最佳条件的具体数据，谢谢您！精确量取 2.5BV猪毛菜黄酮提取液(质量浓度 1.25g/L、pH=4.5)以 2mL/min的流速缓慢加入已预处理好的 AB-8树脂柱中。 待吸附完毕后，用蒸馏水洗脱杂质，再分别用体积分数为 20%、40%、60% 、80% 、95%乙醇溶液以 2mL/min的速度进行洗脱，收集洗脱液，测定黄酮质量浓度，考察乙醇体积分数对解吸率的影响，结果见图 6。如图 6所示，随着乙醇体积分数的增加，解吸率不

34、断上升，当乙醇体积分数为 80%时解吸率达到最大值，解吸率为 84.38%。这是因为被分离物质与树脂之间具有一定的范德华力，当两者极性相近时范德华力最大。由于 AB-8树脂为弱极性树脂，吸附的黄酮极性较小，故乙醇体积分数越高洗脱效果越明显。但当乙醇体积分数达到 95%时，大量杂质也被洗脱下来，导致解吸率下降。因此，选择 80%乙醇作为洗脱剂。20 40 60 80 100405060708090Ethanol concentration/%Desorptionrate/%图 6 乙醇体积分数对解吸率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on deso

35、rption rate of AB-8 resin2.2.5 洗脱流速对洗脱效果的影响精确量取 2.5BV猪毛菜黄酮提取液(质量浓度 1.25g/L、pH=4.5)以 2mL/min的流速缓慢加入已预处理好的 AB-8树脂柱中。 待吸附平衡后用蒸馏水洗去水溶性杂质，用 80%乙醇溶液洗脱，调节恒流泵的流速分别为 0.5、1、1.5、2、2.5、3mL/min，收集洗脱液，计算解吸率，结果见图 7。由图 7可知，随着洗脱流速的增加解吸率降低，这是因为流速太大时洗脱剂未能充分洗脱树脂上吸附的黄酮就被流出柱外。但流速过低，会造成整个洗脱过程变长，综合考虑，将洗脱流速选择为 1mL/min。0.5 1

36、 1.5 2 2.5 36065707580859095Elution flow rate/(mL/min)Desorptionrate/%图 7 洗脱流速对解吸率的影响Fig.7 Effect of flow rate of ethanol on desorption rate of AB-8 resin2.2.6 洗脱剂用量对洗脱效果的影响精确量取 2.5BV 猪毛菜黄酮提取液(质量浓度 1.25g/L、pH=4.5)以 2mL/min 的流速缓慢加入已预处理好的 AB-8 树脂柱中。 待吸附完毕后用蒸馏水洗脱杂质，再用 80%乙醇溶液以 1mL/min 的速度进行洗脱，收集洗脱液，测定黄

37、酮质量浓度，考察乙醇用量对解吸率的影响，结果见图 8。如图 8 可知，在开始的 1BV，总黄酮的浓度不断增加，当洗脱体积4BV 时，黄酮已基本洗脱完全。因此，选取 4BV 为洗脱剂用量。0 1 2 3 4 500.511.522.533.54Desorption solvent amout/BVConcentrationoftotalflavonoids(g/L)图 8 洗脱剂用量对解吸率的影响Fig.8 Effect of desorption solvent amount on desorption rate of AB-8 resin2.3 验证实验按 1.2.1 节方法提取的猪毛菜总黄

38、酮的质量分数为 10.20%。按上述优选的最佳工艺条件进行验证，平行 3 份，结果见表 3。由表 3 可知，总黄酮的质量分数从纯化前 10.20%增加到纯化后 51.89%，回收率为 84.43%，表明此工艺条件稳定可行。表 3 猪毛菜总黄酮的质量分数Table 3 Mass fraction results of the total flavonoids样品 质量分数/% 回收率/%纯化前 10.20 82.96纯化后 1 52.03 84.92纯化后 2 53.45 85.63纯化后 3 50.18 82.75平均值 51.89 84.432.4 树脂的重复使用实验精确量取 2.5BV 猪

39、毛菜黄酮提取液(质量浓度 1.25g/L、pH=4.5)以 2mL/min 的流速缓慢加入已预处理好的 AB-8 树脂柱中。待吸附完毕后用蒸馏水洗脱杂质，再用 4BV 体积分数为 80%的乙醇溶液以 1mL/min 的速度进行洗脱，收集洗脱液，测定黄酮质量浓度。 在同一根树脂柱上重复实验 5 次，分别计算 5 次的动态吸附量和解吸率，结果见表 4。由表 4 可Comment jxhg_lcy17: 此处请给出参考文献您好，文中已添加了参考文献，谢谢您的建议！Comment jxhg_lcy18: 请分析纯化后黄酮对氧自由基的清除活性低于抗坏血酸的原因。您好，非常感谢您提出的宝贵意见。抗坏血酸又

40、称维 C，维 C是一种较强的抗氧化剂，纯化后的黄酮虽然具有有效的超氧阴离子自由基清除活性，但相同浓度下清除率还是低于维 C的，谢谢您！知，树脂的重复使用性能较好，重复使用 5次后，树脂的吸附量没有明显降低，解吸率降低了 9%左右。表 4 树脂的重复使用实验结果Table 4 Reuse experiment results of resin次数 1 2 3 4 5吸附量(mg/g) 12.56 12.38 12.14 11.83 11.52解吸率(%) 90.26 89.63 87.38 85.16 81.532.5 纯化黄酮的体外抗氧化活性2.5.1 羟自由基清除活性羟基自由基是生物体代谢过

41、程中产生的，是具有强烈毒性的自由基。它能够与活细胞发生生物反应，导致氧化损伤或细胞坏死，与衰老、癌症等疾病密切相关。因此，筛选安全有效的羟基自由基清除物质逐渐成为研究的热点 27。纯化黄酮对羟基自由基的清除活性见图 9。由图 9可知，纯化后的猪毛菜黄酮溶液和抗坏血酸均有一定的清除羟自由基的能力。当浓度从 0.1g/L增加到 0.5g/L时，猪毛菜黄酮的羟基自由基清除率从 44.963.63%增加到 88.126.05%。并且浓度低于 0.4g/L时，黄酮的清除率大于抗坏血酸。这表明纯化总黄酮对羟基自由基具有很强的清除活性。0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5020406080100 纯

42、化 总 黄 酮抗 坏 血 酸Concentration(g/L)Hydroxylradicalscavengingpercentage/%图 9 不同浓度纯化总黄酮的羟自由基清除活性Fig.9 hydroxyl radical scavenging effects of the purified flavonoids at different concentrations2.5.2 超氧阴离子自由基清除活性超氧阴离子自由基作为许多活性自由基的前体，具有较强的活性，可直接导致细胞DNA损伤。此外，它还可以转化为氧化活性更强的羟基自由基 28，因此本文测定了纯化后黄酮对超氧阴离子自由基的清除活性，结果见图 10。从图 10可以看出，当黄酮浓度从0.1g/L增加到 0.5g/L时，氧自由基清除率从 7.601.65%增加到 45.945.14%。然而，纯化后黄酮对氧自由基的清除活性低于抗坏血酸，但这也表明纯化黄酮对超氧阴离子自由基具有有效的清除活性。