番茄质体转化载体pTom-GFPaadA的构建.DOC

1、1番茄质体转化载体 pTom-GFPaadA 的构建夏蓓蓓 翟军鹏 陈吉裕 张香琴 张兴国 *西南大学园艺园林学院，重庆 400716摘要：采用 PrimStar HS DNA 聚合酶从番茄基因组 DNA 中扩增出了质体的 trnI-trnA 基因序列。序列分析结果表明，所克隆的基因与 GenBank 公布的序列完全相同，与烟草的 trnI-trnA 基因序列同源性高达 94%。将该片段作为定点整合外源基因的同源重组片段，构建成包含 Prrn:gfp-aadA:TpsbA 表达盒的番茄质体定点转化载体pTom-GFPaadA，酶切鉴定表明，所构建的载体符合预期设计。关键词：番茄；质体；trnI

2、-trnA 基因；载体 pTom-GFPaadA番茄是世界上重要的蔬菜作物之一。它色泽鲜艳、口感宜人，可鲜食、菜用和加工，能为人们提供多种天然的维生素和矿质元素，因而深受消费者喜爱 1,2。目前，利用基因工程的方法进行番茄品种性状改良的研究取得了很大的进展，但多停留对核基因组的转化，而核基因组转化中存在位置效应、转基因沉默及外源基因表达量低等问题。自从 1990 年高等植物烟草的叶绿体转化获得成功以来 3，质体转化已经在许多物种中获得了成功，且以其独特的优越性成为植物基因工程的研究热点，但除烟草以外，其他植物的质体转化依然难度较大 4。质体转化通过同源重组的方式将外源基因定点整合到质体基因组上

3、，因此，质体转化载体具有物种专一性。Daniel 等利用烟草质体基因 trnA 和 trnI 作为同源重组片段，构建了可用于不同植物的通用质体转化载体（universal vector） 5。目前已有多种作物利用该载体实现了外源基因在质体中的稳定表达 6，但是转化效率很低 7,8。可见，要解决番茄质体转化的难题，构建番茄物种专一性的质体基因表达载体非常必要。本研究参照已公布的番茄质体的 trnI-trnA 基因序列设计引物，从番茄基因组中克隆了 trnI-trnA 基因片段，并以此作为定点整合的同源片段，构建了包含 GFP 基因、选择标记基因 aadA及质体特异性启动子 Prrn 和终止子 T

4、psbA 的番茄质体表达载体，其结果对提高番茄质体转化的效率具有重要的利用价值。1 材料和方法1.1 材料和试剂材料为普通番茄（Solanum lycopersicum L.）品种Ailsa Craig。pVCT2161由本实验室构建。pBio3-GFP、大肠杆菌菌株DH5等由本实验室保存。pMD18-T载体购自TaKaRa 公司。1.2 方法1.2.1 番茄基因组DNA的提取 参照CTAB法提取番茄幼嫩叶片中的基因组 DNA9。1.2.2 番茄trnI-trnA基因区段的克隆根据番茄质体的trnI-trnA基因序列（ acc#: NC_007898） ，设计合成一对引物P1: 5-gtatt

5、ttggtttgacactgcttcacacc-3和 P2: 5-gtatcggctaagttcacgagttgc-3，分别位于TrnI基因的上游和TrnA 基因的下游。以番茄的总DNA为模板，采用PrimStar HS DNA 聚合酶（TaKaRa Co.，Japan）进行PCR扩增。扩增条件为：98 1 min，1个循环；98 10 sec， 59 15 sec，72 2 min，28个循环；72最后延伸10 min。PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳分离后回收，再用Taq DNA 聚合酶加“A”尾，TA克隆到pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，以P1/P2为引物对菌落进行PCR筛

6、选，阳性克隆(pMD-trnIA) 委托上海博尚生物技术有限公司测序。基金项目: 国家自然科学基金项目资助（30972008）作者简介：夏蓓蓓，1984-，女，湖北钟祥人，硕士研究生，主要从事蔬菜分子生物学方面的研究。通讯作者：张兴国，研究员。21.2.3 番茄质体表达载体的构建对质粒 pMD-trnIA 和 pVCT2161 均进行 Ase I 和 Sal I 双酶切，分别回收 2264 bp 的小片段和 2633 bp 的大片段，回收片段经 T4 DNA 连接酶 16条件下过夜连接，连接产物转化 E.coli DH5 感受态细胞，对菌落进行 PCR 筛选，阳性菌落提取质粒 DNA 用 Ec

7、oR I 和 Sac I 进行双酶切鉴定，获得载体pKn-trnIA。载体 pKn-trnIA 和 pBio3-GFP 分别经 BstX I 和 Sac I 双酶切，分别回收 4742 bp 的大片段和2197 bp 的小片段，连接转化条件同上。对菌落进行 PCR 筛选，阳性菌落提取质粒 DNA 用 Sac I 和Hind III 双酶切鉴定，获得重组质粒 pTom-GFPaadA，载体构建流程见图(2A)。2 结果与分析2.1 番茄 trnI-trnA 基因片段的克隆与序列分析以番茄 gDNA 为模板、p1/p2 为引物，扩增得到长度约为 2 kb 的 trnI-trnA 基因片段（图 2B

8、） ，TA克隆入 pMD18-T 载体，PCR 筛选出阳性克隆，获得重组质粒 pMD-trnIA。双向测序结果表明，序列测定结果同 GenBank 中公布的序列完全相同，全长 2041 bp（图 1） 。将该序列与烟草 TrnI-TrnA 片段对应区域相比较，两者有 5 处差异（图 1）,不同碱基相差 6.1%左右。2.2 得到了番茄质体基因表达载体用 EcoR I 和 Sac I 对载体 pKn-trnIA 进行双酶切，结果经 1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测，得到 3548 bp和 1349 bp 的符合预期大小的条带（图 2C） ，表明载体 pKn-trnIA 构建成功。用 Sac I 和

9、Hind III 对载体 pTom-GFPaadA 进行双酶切，结果经 1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测，得到 4230 bp 和 2121 bp 的符合预期大小的条带（图 2D） ，说明载体 pTom-GFPaadA 构建成功。3 讨 论一般来说，质体基因表达载体具有物种专一性，异质的同源转化载体虽然可以用于不同作物的质体转化，但转化效率很低。马铃薯中采用同源性约 98%的异质同源序列实现了质体转化，但是转化效率比烟草低 10-35 倍 7,8，而采用完全同源的重组序列在烟草、胡萝卜、棉花和大豆中的转化效率相对较高 10。本实验中克隆的番茄 TrnI-TrnA 片段的序列与烟草 TrnI-Trn

10、A 片段序列对应区域相比较有较高的同源性，不同碱基相差 6.1%左右（图 1） 。所构建的番茄质体转化的特异定点整合载体，可为提高番茄质体转化效率、促进番茄的质体遗传改良等方面研究奠定基础。迄今为止，质体基因组转化技术只在拟南芥 11、烟草 3、油菜 12、番茄 8、马铃薯 7和水稻 13等少数植物中获得成功，且转化效率远低于模式植物烟草。因此，建立高效、快速的质体基因组转化体系并扩大其应用范围迫在眉睫。番茄是最早进行基因转化研究的高等植物之一，也是我国第一个被批准商业化生产的转基因作物，因此，番茄基因工程必将获得快速发展，而质体基因工程以其巨大优势为番茄基因工程带来了新的生机和活力。本实验构

11、建的番茄质体转化载体为番茄质体转化奠定了基础，以期在番茄品种改良中发挥巨大的作用。SL：GTATTTTGGTTTGACACTGCTTCACACC=/=GTCCCTAATCA=/=TTTAGGTTCGGCCTCAATG=/=AGATCACCCCT=/=NT：GTATTTTGGTTTGACACTGCTTCACACC=/=GTCCCCAATCA=/=TTTAG-CAATG=/=AGATCGCCCCT=/=SL：GAAATCGAAATGGGAG=/=TCTTAAAACCAGCGTTCTTAAGACCAAAGAGTCGGGCGGAAGGGGGGGAAAGCCCTCCGTTCCTGNT：GAAAT-GGG

12、AG=/=TCTTA-SL：GTTCTCCTGTAGTTGGATTTGGATCCTCCGGAACCACAAGAATCCTTAGTTAG=/=CCAACTCGTGAACTTAGCCGATACNT：-GTTAG=/=CCAACTCGTGAACTTAGCCGATAC图 1.番茄和烟草的 trnI-trnA 基因序列比对SL: 本文克隆的番茄 trnI-trnA 基因序列；NT: GenBank 公布的烟草 trnI-trnA 基因序列；黑底白字部分为比对相同序列，=/=区域比对相同区域的省略部分，白底黑字部分为比对差异序列。3参考文献：1 王大平. 水杨酸对番茄贮藏品质的影响J. 西南大学学报( 自

13、然科学版) , 2008, 30 (2): 77-80.2 王逸群, 李田. 乙肝病毒表面抗原基因对番茄的遗传转化及转基因番茄植株的获得 J. 西南大学学报(自然科学版) , 2008, 30 (7): 78-83. 3 Svab Z, Hajdukiewicz P, Maliga P. Stable transformation of plastids in higher plantsJ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 8526-8530.4 Maliga P. Plastid transformation in higher plantsJ.

14、Annu. Rev. Plant Biology, 2004, 55: 289-313.图 2. 番茄质体转化载体 pTom-GFPaadA 的构建与鉴定A: 番茄质体转化载体 pTom-GFPaadA 的构建流程；B：番茄 trnI/A基因的 PCR 扩增；C： pKn-trnIA 质粒 DNA 酶切鉴定；D：pTom-GFPaadA 质粒酶切鉴定；tom-trnI 和 tom-trnA：用于同源重组的番茄质体 DNA 片段；Prrn：经改造的烟草质体 16S rRNA 基因启动子； GFP：绿色荧光蛋白基因；aadA: 原核壮观霉素抗性基因；TpbsA：烟草质体 pbsA基因终止子；Col

15、EI：大肠杆菌质粒复制子；npt：原核新霉素磷酸转移酶基因；M:DNA/E coR+H ind Marker；Lane 1：trnI/A 基因的 PCR 扩增；Lane 2：pKn-trnIA 的质粒 DNA；Lane 3：pKn-trnIA 的 EcoR I 和 Sac I 酶切产物；Lane 4：pTom-GFPaadA/H ind III+Sac I酶切；Lane 5：pBio3-GFP/H ind III+Sac I酶切。AseI/SalI收 2633 bpAseI/SalI收 2264 bp番茄 gDNASL-trnI SL-trnABstXI/SacI收 2197 bpBstXI/

16、SacI收 4742 bpM 1-2000bpBC3 2M-3548bp-1349bp5 4M-4230bp-2121bpDA45 Daniell H, Datta R, Varma S, et al. Containment of herbicide resistance through genetic engineering of the chloroplast genomeJ. Nature Biotechnology, 1998, 16(4): 345-348.6 Daniell H, Kumar S, Dufourmantel N. Break through in chloropl

17、ast genetic engineering of agronomically important cropsJ. Trends in Biotechnology, 2005, 23: 238-245.7 Sidorov VA, Kasten D, Pang SZ, et al. Stable chloroplast transformation in potato: use of green fluorescent protein as a plastid marker J. The Plant Journal, 1999, 19(2): 209-216.8 Ruf S, Hermann

18、M, Berger IJ, et al. Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruitJ. Nature Biotechnology, 2001, 19: 870-875.9 Scott OR, Arnold JB. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh herbarium and mummified plant tissuesJ. Plant Molecular Biology, 1985,

19、 5: 69.10 Maliga P. Engineering the plastid genome of higher plantsJ. Plant Biology, 2002, 5: 164-172.11 Sikdar SR, Serino G, Chaudhuri S, and Maliga P. Plastid transformation in Arabidopsis thalianaJ. Plant Cell Rep. 1998, 18: 20-24.12 Hou BK, Zhou YH, Wan LH, et al. Chloroplast transformation in o

20、ilseed rapeJ. Transgenic Res. 2003, 12: 111-114.13 Lee SM, Kang K, Chung H, et al. Plastid transformation in the monocotyledonous cereal crop, rice (Oryza sativa) and transmission of transgenes to their progenyJ. Mol Cells. 2006, 21: 401-410.Construction of Tomato Plastid Transformation Vector pTom-

21、GFPaadAXia Bei-Bei, Zhai Jun-Peng, Chen Ji-Yu, Zhang Xiang-Qin, Zhang Xing-Guo*（College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest Uni., Chongqing 400715, China）Abstract：The plastid trnI-trnA gene was amplified from tomato gDNA by means of PCR using PrimStar HS DNA polymerase. The cloned

22、fragment completely consisted with the recorded sequence of tomato in GenBank, which shared above 94% identities with that from tobacco. The fragment was used as homologous targeting sequences to construct the tomato-specific plastid transformation vector named pTom-GFPaadA containing the expression cassette of Prrn:gfp-aadA:TpsbA. Finally, the pTom-GFPaadA was obtained and verified by digestion with restriction enzymes.Key words：Tomato ；Plastid；trnI-trnA genes；Vector pTom-GFPaadA