蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。5、转化到DH5感受态细菌中扩增,提质粒。6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。7、蛋白的诱导表达。1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25M到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。甘油是用0.22m过滤除菌的,储存浓度一般是30%
