外源 DNA 和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接,也就是在双链DNA5 磷酸和相邻的 3 羟基之间 形成的新 的共价链。如质粒载体的两条链都带 5 磷酸,可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化, 则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口,当杂本导入感 受态细胞后可被修复。 相邻的5 磷酸和3 羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催 化,这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中,T4噬菌 体DNA连接酶都是首选的用酶。 这是因为在下沉反应条件下, 它就能有效地将平端DNA片段连接起来。 DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应,在标准条件下,其反应速度完全由互相匹配的DN A末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子(分子内连接还是位于不同分子(分子间连接 ,都是 如此。现考虑一种简单的情况,即连接混合物中只含有一种DNA,也就是用可产生粘端的单个限制酶切 割制备的磷酸化载体DNA。在瓜作用的底物。如果反应中DNA浓度低,则配对的两个末端同一DN
