大豆粕碱性蛋白酶水解肽及ACE抑制活性的研究（.DOC

1、1大豆粕碱性蛋白酶水解肽及 ACE 抑制活性的研究 温雪琴 1，刘屾 1，黄弢 1，赵嘉希 2，冯欣 1*，孙建华 1（1.天津市动植物抗性重点实验室，天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津科技大学，天津 300222 ) 摘 要：豆粕是大豆经浸提脱脂后得到的副产品，含有大量的大豆蛋白，其水解物对血管紧张素转移酶（ACE）具有明显的抑制作用和降压效果。结果表明：以食品级豆粕为原料，经碱性蛋白酶水解后得到的 ACE 抑制肽在 pH8.0，温度 50 ，豆粕底物浓度 40 g/L 的条件下，酶解 3 h 得到的产物 ACE 抑制活性最高，为 64.21 ，对应水解度 14.86 ；

2、进一步对 ACE 抑制肽进行高效液相色谱（HPLC）以及超高压液相色谱/四极杆-飞行时间串联质谱联用仪(LC-MS) 的分析结果显示：活性物质的主要组分为三肽化合物，分子量为 359，分子式为 C15H30N6O4，由异亮氨酸、精氨酸和丙氨酸构成；其 HPLC 检测条件为色谱柱：Zorbax300SB-C18，5 m，4.6150 mm；检测波长：228 nm，流动相：50 %甲醇-超纯水，各含 0.1 %三氟乙酸；流速：0.7 mL/min；柱温： 26 ；进样量：10 L。关键词：豆粕；碱性蛋白酶；ACE 抑制肽；高效液相色谱法 HPLC；ACE inhibitory Activity o

3、n Hydrolytic Peptides from Soybean Meal hydrolyzed by Alkaline Protease WEN Xue-qin1，LIU Shen 1，HUANG Tao 1，ZHAO Jia-xi 2，FENG Xin 1*，SUN Jian-hua 1(1.Tianjin Key Laboratory of Animals and Plants Resistance，College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin，300387，PR China；2.Tianjin Universi

4、ty of Science and Technology，Tianjin 300222，China)Abstract：Soybean meal, as a byproduct of soybean oil manufacture, contains mainly of protein. Peptides derived from the protein had been proven to be angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory and antihypertensive effect. Food-grade soybean meal

5、was hydrolyzed by alcalase for the preparation of ACE inhibitory peptides. The optimum enzymolytic conditions for the preparation were at pH8.0, 55 for 3 h and a substrate concentration of40 g/L. The ACE inhibitory activity and the degree of hydrolysis (DH) were separately high up to 64.21 and 14.86

6、 %. Subsequent detection of high performance liquid chromatographic (HPLC) and High pressure liquid chromatography / quadrupole - time of flight tandem mass spectrometry (LC-MS) suggested that the active fraction might be tripeptide with molecular weight of 359 and the molecular formula of C15H30N6O

7、4 which constitute of Isoleucine, Arginine and Alanine. Its HPLC conditions were determined as follows: column, ZORBAX SB-C18(4.6 mm id150 mm, 5 um); detection wavelength, 228nm; mobile phase, methanol - ultra-pure water (50:50, v/ v, both containing 0.1%(v/ v) trifluoroacetic acid; flowrate, 0.7 mL

8、/min;column; temperature, 26 ; sample size,10 l. Key words：Soybean meal ; Alcalase; ACE inhibitory peptides; high performance liquid chromatographic HPLC豆粕是大豆榨油的副产物，一般用做饲料。豆粕蛋白含量很高，以其为底物，用酶解法可以制备具有降血压作用的 ACE (血管紧张素转换酶 angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制肽 1。ACE 对血压起着重要的调节作用，它可以水解血管紧张素 I（Angiotensin

9、I, Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Pro-His-Leu） ，生成的血管紧张素 II 具有升高血压作用，同时还可以水解舒缓激肽（ Bradykinin，Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Arg） ，使其失去降压作用 2。中国高血压防病指南将血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI) 明确列为五种最常用的降压药物之一 3，自 1977 年 ACEI 问世以来已成为防治心血管疾病的“基石”药物 4。有关试验表明，人工合成的ACE 抑制剂会产生一些副作用，而食品级蛋白源降压肽由于其安全性很高，只对高血压患者起到降压效作者简介：温雪琴（1989），女，（汉），硕士研究生，研究方向：微生物应用

10、及发酵工程。通信作者：冯欣（1981），女，（汉），实验师，硕士研究生，微生物应用及发酵工程。2果，对血压正常者无降压作用，且降压作用平稳而温和。因此，具有降压作用的大豆 ACE 抑制肽备受关注 5-6，但以食品级豆粕为原料制备 ACE 抑制肽的研究相对较少。开发大豆降压食品不仅可以为心脑血管病患者提供一种物美价廉，安全可靠的保健食品还可以大幅度提高大豆产品的附加值，拓宽大豆的用途。同时，伴随生物技术的不断进步与生命科学的巨大发展，人们发掘出越来越多有关大豆多肽的功能，而某些抑制肽的结构与生理功能也逐渐被人们所认识和了解，推动了人类对大豆抑制肽进行研究与开发 7。据此，实验以食品级大豆粕为原料

11、制备具有降血压作用的大豆多肽并对其性质和 ACE 抑制活性进行研究，为大豆降压肽的开发应用提供理论支撑。1 材料与方法1.1 材料与试剂食用级豆粕：市购；碱性蛋白酶：天津市诺奥科技发展有限公司；硼酸(分析纯) ：天津市风船化学试剂科技有限公司；硼砂(分析纯 )：天津市元立化工有限公司；三氟乙酸 (分析纯)：上海市科丰试剂厂；甲醇(色谱纯 )：美国迪马科技公司；马尿酰组氨酰亮氨酸（ Hippury-L-histidyl-L-leucine，Hip-His-Leu）：美国 sigma 公司；ACE(来自兔肺) ：美国 sigma 公司。1.2 仪器与设备高效液相色谱仪 1200 、超高压液相色谱/

12、 四极杆- 飞行时间串联质谱联用仪(配有电喷雾离子源(ESI) ： 美国安捷伦1.3 方法1.3.1 酶解抑制肽样品的制备称取豆粕，分别配制成 20、40 和 60 g/L 水溶液，50恒温搅拌 20 min。1mol/L NaOH 调 pH8.0，同时加入 3 %（E/S）的碱性蛋白酶。为保证溶液 pH 稳定，需不断向体系加入 NaOH，同时记录加入量，用于计算水解度。分别于 1、2、3、4、5、6、9、12h 取样，立即于 90 水浴 15 min，钝化蛋白酶。流水冷却后 4 12 500 r/min 离心 15 min，取上清液冻干得到抑制肽样品。水解度的测定采用 pH-STAT 法 8

13、。1.3.2 色谱及质谱仪器条件1.3.2.1 色谱条件色谱柱：Zorbax300SB-C18，5 m，4.6150 mm；检测波长：228 nm，流动相：50 %甲醇- 超纯水,各含 0.1 %的三氟乙酸；流速： 0.7 mL/min；柱温：26 ；进样量： 10 L1.3.2.1 色谱条件离子源：ESI；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM） ；电喷雾电压：5500 V；离子源温度：500 ；正离子模式下喷雾毛细管电压为 4.0 KV，雾化气为 N2 气流量为 11L/min，干燥气压力为 45 Pa，IT 真空为 2.810-5Tor；TOF 真空为 2.5610-7，干燥

14、气温度为 200 ，质谱采集范围 m/z 50-3000。1.3.3 ACE 抑制肽活性检测方法1.3.3.1 试剂的配制（1）马尿酸标准液：取一定量的马尿酸标准品，加去离子水溶解配成浓度为 25 g/mL 的马尿酸标准液，并逐级稀释成一系列浓度 20、15、10、5、2、1、0.5、0.1 g/mL。（2）硼酸缓冲液（pH8.3，含 0.3 mol/L NaCl）：溶液 A：称取硼酸 3.092 5g，用去离子水溶解定容至 500 mL；溶液 B：称取硼砂 4.767 5 g，用去离子水溶解定容至 500 mL；取 A 液 120 mL，B 液 80 mL， NaCl 3.51 g，混合至完

15、全溶解，即为 0.1 mmol/L 的硼酸缓冲溶液。（3）ACE 溶液：将 0.25 U ACE 溶于 2.5 mL 0.1 mol/L 硼酸缓冲液（ pH8.3，含 0.3 mol/L NaCl）即得；（4）HHL 溶液（ 5 mmol/L）：取适量 HHL 溶解于 0.1 mol/L 硼酸钠缓冲液(pH8.3 含 0.3 mol/L NaCl）中，配置成 5 mmol/L HHL 溶液；3（5）称取适量冷冻干燥后的抑制肽粉末，将其溶于一定量的 0.1mol/L 硼酸缓冲溶液（pH8.3，含 0.3 mol/LNaCl）中，制成 0.5 mg/mL 抑制肽溶液1.3.3.2 ACE 抑制肽活

16、性测定反应体系总体积为 120L。测定管：取抑制肽样品 60L 与 ACE 溶液 10L 混合，37水浴 10 min 后加入 HHL 溶液 50L ；整个反应体系 37水浴 60 min 后加入 1 mol/L HCL 100L 终止反应；过 0.45m 滤膜，进行液相色谱分析。对照管：用 60 L 硼酸缓冲液（pH8.3 0.3 mol/L NaCl）替代测定组抑制肽溶液，用同样方法制备反应液。空白对照管：用 10L 硼酸缓冲液（pH8.3 0.3 mol/L NaCl）替代对照组 ACE 溶液，同样方法制备反应液（平行 3 次）。计算公式为 ACE 抑制率（%）= （HAcHAs）/ （

17、HAc HAH）100 %式中，HAc：对照样品马尿酸浓度；HAs：测定样品马尿酸浓度；HAH：空白对照中马尿酸浓度。2 结果与分析2.1 检测波长的测定图 1 马尿酸与 HHL 紫外吸收光谱Fig.1 UV scanning spectrum of hippuric acid and HHL分别以 0.1 mol/L 的硼酸缓冲液( pH8.3，含 0.3 mol /L NaCl )和去离子水为参比，在 190 nm 300 nm 波长处扫描马尿酸溶液和 HHL 溶液的紫外吸收光谱，如图 1 所示。从图可以看出三肽 HHL 在 210 nm -250 nm 波长范围内有一定的吸收，而马尿酸在

18、 228 nm 波长处有一特征吸收峰。因此可以用 228nm 作为HPLC 的检测波长。2.2 流动相的选择及保留时间的确定图 2 HHL 液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of HHL马尿酸马尿酸4图 3 马尿酸液相色谱图Fig. 3 HPLC chromatogram of hippuric acid在 1.3.2.1 节选定的条件下马尿酸及 HHL 的液相色谱图如图 2 和图 3 所示，此色谱条件下，样品、马尿酸、HHL 能够实现很好的区分, 各峰区分度较好，马尿酸峰能和其它峰独立区分不受干扰。对加样品后的多组反应液检测后，马尿酸的峰面积减小，且出峰时间也很稳定。

19、HHL 的保留时间为 Rt = 6.168 min，马尿酸的保留时间为 Rt =3.023 min。2.3 抑制肽活性测定结果2.3.1 马尿酸标准曲线及回归方程将配置好的不同浓度的马尿酸溶液过 0.45m 滤膜后进行液相分析，结果表明马尿酸的峰面积（mAUS）及其浓度 C（g/mL ）呈现良好的线性关系，线性回归方程是：y=92.695 8x-13.91，如图 4 所示。因此，马尿酸的峰面积可以很好的反映体系中马尿酸的浓度，进一步体现出 ACEI 的抑制活性。试验中所有样品反应体系中马尿酸的浓度全部在标准曲线范围内。图 4 马尿酸峰面积标准曲线Fig.4 The standard curve

20、 of hippuric acid2.3.2 不同底物浓度的酶解产物 ACE 抑制效果50204060801000 3 6 9 12水 解 时 间 t/(h)ACE抑制率/(%)20g/L40g/L60g/L图 5 碱性蛋白酶制备的 ACE 抑制肽活性Fig.5 inhibition of ACE peptide made by alcalase随着底物浓度的增加，酶解大豆肽的活性略有升高，并且同时在 3h 时获得最高活性产物。但是考虑到生产成本以及前期处理和后期分离浓缩的困难，应尽量提高底物浓度。综合考虑下，确定 40g/L 底物浓度下进行水解较适宜。 （见图 5） 2.3.3 水解度与 A

21、CE 抑制活性关系从图 6 可以看出，在水解反应的 0 到 9 h 内，水解度一直呈上升的趋势。在水解的初始阶段 0 到 3 h，ACE 抑制肽活性随着水解度的增加而增强 9，随后便逐渐下降。这是因为在水解反应的后期，ACE 抑制肽被水解成小分子的氨基酸，使得其活性被破坏。因此酶解 3 h 的产物活性最高，为 64.21，对应水解度 14.86 。这与 Mullally10-11等的研究结果是一致的，他认为在酶解反应初始阶段，ACE 抑制肽被大量生成，但之后被逐步降解，从而导致 ACE 抑制活性下降。06121824300 3 6 9水 解 时 间 t(h)水解度DH/(%)020406080

22、100抑制率/(%)水 解 度 DH抑 制 率图 6 水解度与抑制率的关系Fig. 6 The diversification for DH and ACE inhibitory ratio2.4 高活性肽性质初步分析及测定很多具有生理活性的生物活性肽都与其分子量有一定的关系 12。为了明确酶解产物所含物质的分子量，对 ACE 抑制活性最高的 3 h 酶解产物进行液质分析，结果如图 7。结果显示样品中主要含有两种主要物质，分子量分别为 359 和 441，对应分子式为 C15H30N6O4 和 C24H36N6O2。经 SciFinder 检测显示C15H30N6O4 是三肽物质，由异亮氨酸、

23、精氨酸和丙氨酸构成 13-14。6图 7 碱性蛋白酶 3h 酶解产物 LC-MS 离子峰Fig.7 LC-MS ion peak of the alcalase hydrolysates （3h）3 结 论在 pH8.0，温度 50 ，底物浓度 40g/L 的条件下，食品级豆粕经碱性蛋白酶水解 3h 产生的 ACE 抑制肽活性最高为 64.21，对应水解度 14.86 。Lin 等从鱿鱼皮肤胃蛋白酶水解肽中获得的分子量小于 2 KDa 的物质，其 ACE 抑制 IC50 值为 0.33 mg/ml15。小麦胚芽蛋白脱脂后的酶解物 ACE 抑制 IC50 值0.452 mg/mL16。与已有文献

24、报道相比，本实验条件下所制备的 0.5 mg/mL ACE 抑制肽表现出了相当ACE 抑制活性，经液质检测其中含有的三肽物质为 C15H30N6O4。因此，本研究为开发食品级豆粕作为具有抗高血压作用的保健食品提供了理论依据，具有很大的发展前景。参考文献1赵芳芳，张日俊.大豆肽研究进展J.中国饲料,2004， (1)：22-23.2何海伦，陈秀兰，孙彩云等.血管紧张素转化酶抑制肽的研究进展 J.中国生物工程杂志，2004，24(9)：7-11.3李瑞杰.中国高血压防治指南（2010 年修订版）重点内容介绍 J.中国临床医生，2012，40(2)：69-72.4陈秋岑，胡世文，杨承建等.抗高血压药

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