复肾颗粒对肾间质纤维化大鼠肾脏的保护作用.DOC

1、复肾颗粒对肾间质纤维化大鼠肾脏的保护作用刘明龙 *1，曾永祥 2，刘天喜 1，卢守燕 1，李建华 1（ 1*兰州大学第一医院肾病科， 2 甘肃省医疗器械检测中心，兰州 730000）摘要 目的：观察复肾颗粒在肾间质纤维化过程中对转化生长因子 激活激酶（TAK1）表达的影响及其可能的肾脏保护作用机制。方法：采用单侧输尿管结扎（UUO）致肾间质纤维化大鼠模型，将 60 只大鼠随机分为 6 组：假手术组（N） 、模型组（M，UUO 组） 、福辛普利组 F0，10mg/(kgd)、复肾颗粒 1 组F1 ，7.5 g/(kgd)、复肾颗粒 2 组F2 ，15 g/(kgd)、复肾颗粒 3 组F3，30

2、g/(kgd)。14d 后处死大鼠，取结扎侧肾组织采用 HE 及 Masson 染色观察病理变化，RT-PCR 和 Western-bloting 检测肾组织 TAK1 和 -SMA 的表达。结果：模型组大鼠肾纤维化程度及肾组织 TAK1 和 平滑肌肌动蛋白（-SMA）的表达较假手术组显著升高（P 50%。1.6.2 实时荧光定量 PCR 法检测各组 TAK1 mRNA 和 -SMA mRNA Trizol法提取总 RNA，用紫外分光光度计测定 RNA 纯度及浓度，两步法 Real Time PCR 反应在 Rotor-Gene 3000 荧光实时定量 PCR 仪（Corbett Resear

3、ch）上进行。取 2 ug 总 RNA 利用反转录酶 PrimeScriptTM Buffer 进行逆转录反应，将 mRNA反转录合成 cDNA，然后以 25ul 体系进行 PCR 扩增，扩增条件为：预变性95 10 s，变性 95 5 s，退火、延伸 60 30 s，共 40 个循环。每个样本重复3 次，以 -actin 为内参照，采用相对定量的 2-CT 法分析 PCR 结果。RT-PCR反应引物序列见表 1。表 1 RT-PCR 引物序列及扩增片段引物名称 引物序列（5-3） 扩增片段（bp）正义链 CCATCCCAATGGCGTATCTTACA 190TAK1反义链 TCATCCTGG

4、TCCAATTCTGCAA正义链 GCAAGCAGGAGTATGACGAGT 112-actin反义链 CTGCGCAAGTTAGGTTTTGTC正义链 ACTGGTATTGTGCTGGACTCCAA 254-SMA反义链 TGATGCTGCTATAGGTGGTTTC1.6.3 Western-bloting 法检测各组 TGF-1,TAK1 和 -SMA 蛋白 肾组织匀浆后取上清液，用 BCA 法检测蛋白质浓度。蛋白样品经 12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳后转移至 PVDF 膜上，用 5%的脱脂奶粉室温下封闭 2 h，将膜用纯化的 TGF-1（1 1000）、T

5、AK1（1500） 、-SMA（ 11000 ）抗体 4 孵育过夜，TBST 洗 3 次 10 min，再用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（15000）孵育 90 min，TBST 洗 3 次10 min，加入免疫印迹化学发光试剂，暗室显影，扫描图像，对照 Marker 确定特异性目的条带。同一张膜曝光后以 0.5% SDS 洗脱抗体，再以 -actin 抗体（11000）孵育杂交，作为内参照。目的蛋白条带与内参条带的累积光密度（IOD）比值为最终结果。1.7 统计学分析 应用 SPSS16.0 软件，计量数据用 s 表示。多组间数据比x较采用单因素方差分析，两组间比较用 t 检验，P 0

6、.05， 4P 0.05， 6P 0.01（下同）2.3 各组大鼠肾组织 TGF-1,TAK1,-SMA 蛋白的表达 TGF-1,TAK1,-SMA 蛋白在假手术组弱表达，模型组表达明显升高（P 0.01） ，各药物组治疗后表达明显下调，与模型组比较差异有统计学意义（P 0.01） ，以复肾颗粒 2组为甚。见表 4 及图 2。表 4 各组大鼠肾组织 TGF-1,TAK1,-SMA 蛋白的表达（ s）x组别 鼠数（只）TGF-1/-actin TAK1/-actin -SMA/-actin假手术组 8 0.4350.038 0.8150.095 0.2560.064模型组（UUO组）12 0.7

7、820.0341 1.5850.1391 1.5820.1011福辛普利组10mg/(kgd)10 0.6670.0251.2 1.4310.0581.2 0.8470.0931.2 复肾颗粒 1 组7.5 g/(kgd)10 0.6960.0161.2.3 1.4650.0411.2.3 0.9290.0841.2.4复肾颗粒 2 组15 g/(kgd)10 0.6080.0231.2.4.6 1.3360.0601.2.4.6 0.7450.0631.2.4.6复肾颗粒 3 组30 g/(kgd)10 0.6510.0201.2.3.5 1.4210.0391.2.3.5 0.8260.0

8、871.2.3.6图 2 各组大鼠 TGF-1,TAK1,-SMA 蛋白表达（Western 印迹）3 讨 论众多研究表明，细胞因子转化生长因子-1（TGF-1）在肾间质纤维化的发生、发展中具有重要作用，阻断 TGF-1 活性被认为可以防治肾间质纤维化【4】 。我们已知肌成纤维细胞的出现是肾纤维化发生的一个重要标志，它的形成、增殖是肾小管间质纤维化的重要病理生理过程，是在多种细胞因子如 TGF-1的刺激下，由成纤维细胞、肾小管上皮细胞及肾小球系膜细胞发生表型转换而成，而 -SMA 已被公认为是肌成纤维细胞的标志蛋白 【5】 。有研究表明，TGF-1、-SMA 与肾小管间质纤维化的程度成正相关

9、【6】 。TAK1 是丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶（MAPKKK）家族成员之一，能被多种细胞因子包括 TGF-1激活参与不同的信号通路 【7】 。目前认为 TAK1 与许多疾病的发生发展密切相关，包括肿瘤、慢性疾病等，最近研究表明，TAK1 在许多肾脏疾病中也起着至关重要的作用。TGF-1 可通过激活 TAK1 介导的 MKK3 途径活化，使小鼠系膜细胞内源性 TAK1 表达活化并增加，由此产生级联放大反应，活化 MKK3-P38-MAPK 途径产生 型胶原 【8】 。复肾颗粒主要由生黄芪、丹参、川芎、大黄、鳖甲等药物组成，具有通腑降浊、补气益肾、活血化瘀、消炎解毒之功效。已有的临床研究表明，川

10、芎嗪可通过降低肾组织中促纤维化因子 TGF-1 含量而达到抗肾间质纤维化的作用【9】 。中药芪红合剂可通过抑制肾组织中结缔组织生长因子（CTGF）的表达，起到减轻肾间质纤维化病变程度的作用 【10】 。复方鳖甲软肝片可通过抑制核转录因子- B（NF-B）的过度表达而减轻肾纤维化的病程进展 【11】 。复肾颗粒是以上有效中药单体的组合方剂，推测其具有改善肾小管间质纤维化和肾小球硬化的作用，值得研究。UUO 模型是目前国际公认的致肾间质纤维化模型，我们通过观察 UUO 术后 14 天的大鼠，从病理上得出梗阻侧肾脏肾小管扩张或萎缩、炎性细胞浸润、间质增宽及胶原大量沉积，说明肾间质纤维化模型制备成功。

11、本实验 RT-PCR及 western-blot 研究结果显示，模型组 TGF-1,TAK1 与 -SMA 的表达较假手术组明显升高，经药物干预后，TGF-1,TAK1 与 -SMA 的表达下降。这说明在疾病状态下，TAK1 与 -SMA 蛋白表达的增加是放大了促纤维化因子 TGF-1 信号活化的重要机制之一。同时也说明，TAK1 和 -SMA 的表达增加可能与TGF-1 等致纤维化因子通过 TAK1 介导的固有细胞 -肌成纤维细胞转分化过程有关。这些研究结果与我们在体外实验通过 TAK1RNA 干扰由 TGF1 诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）增殖的实验结果是一致的，进一步证实了 TAK1

12、与肾小管上皮细胞表型转化之间的关系。另外，在用不同剂量组复肾颗粒干预的过程中，我们发现复肾颗粒中剂量组较其他各组能更好的抑制 TAK1 和 -SMA 的表达，表现为剂量依赖性的关系，由此可见，复肾颗粒对肾间质纤维化大鼠有肯定疗效的可能机制之一是通过抑制 TAK1 和 -SMA 的表达而实现的。参考文献1 张翠，董佳涛，王海英.通腑泄浊汤对肾间质纤维化大鼠 -SMA、LN、Col表达的影响J.中成药，2008，30（11）：1584.2 Shin MS，Singhirunnusorn P，Sugishima Y，et al.Cross interference with TNF-alpha-in

13、duced TAK1 activation via EGFR-mediated p38 phosphorylation of TAK1-binding protein 1J.Biochim Biophys Acta，2009，1793（7）：1156. 3 Li J，Zhang Z，Wang D，et al.TGF-beta 1/Smads signaling stimulates renal interstitial fibrosis in experimental AANJ.J Recept Signal Transduct Res，2009，29(5) ：280.4 Hills CE，S

14、quires PE.TGF-beta1-Induced Epithelial-to-Mesenchymal Transition and Therapeutic Intervention in Diabetic NephropathyJ.Am J Nephrol，2010，31(1)：68.5 Veerasamy M，Nguyen TQ，Motazed R，et al.Differential regulation of E-cadherin and alpha-smooth muscle actin by BMP 7 in human renal proximal tubule epithe

15、lial cells and its implication in renal fibrosisJ.Am J Physiol Renal Physiol，2009，297(5)：F1238.6 杨晓萍，林智峰，张春江，等.肾间质纤维化动物模型中整合素连接激酶及相关因子的表达J.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（2）：258.7 Lluis JM，Nachbur U，Cook WD，et al.TAK1 is required for survival of mouse fibroblasts treated with TRAIL, and does so by NF-kappaB d

16、ependent induction of CfliplJ.PloS One，2010，5(1)：e8620.8 Kim SI，Kwak JH，Wang L，et al.Protein phosphatase 2A is a negative regulator of transforming growth factor-beta1-induced TAK1 activation in mesangial cellsJ.J Biol Chem，2008，283(16)：10753.9 陆敏，周娟，王飞，等.川芎嗪对肾间质纤维化模型大鼠 Smad 和 SnoN 蛋白表达的影响J.中国中药杂志，2009，34（1）：84.10 董华玲，马华.中药芪红合剂对肾间质纤维化模型大鼠肾组织中 CTGF 表达的影响J.中外医疗，2009， （4）：10.11 谷海瑛，赵宗江，杨美娟.复方鳖甲软肝片对单侧输尿管结扎大鼠肾组织NF-B 表达的影响J.中国中西医结合肾病杂志，2005，6（3）：137.