没食子酸纳米硒抗氧化性的测定-食品质量与安全毕业论文.doc

1、本科毕业论文（20 届）没食子酸纳米硒抗氧化性的测定所在学院 专业班级 食品质量与安全 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 没食子酸纳米硒抗氧化性的测定目 录摘 要 .IAbstract .II引 言 .III1 材料与方法 .- 1 -1.1 实验材料 .- 1 -1.1.1 主要原料 .- 1 -1.1.2 主要实验试剂 .- 1 -1.1.3 主要实验仪器设备 .- 1 -1.1.4 试剂的配置 .- 2 -1.2 实验方法 .- 2 -1.2.1 清除羟基自由基的测定 .- 2 -1.2.1.1 实验原理 .- 2 -1.2.1.2 实验步骤 9-11.- 2 -1.2.

2、2 ABTS+自由基清除能力的测定 .- 3 -1.2.2.1 实验原理 .- 3 -1.2.2.2 实验步骤 12-13 .- 3 -1.2.3 还原力的测定 .- 3 -1.2.3.1 实验原理 .- 3 -1.2.3.2 实验步骤 14-15 .- 4 -2 结果与分析 .- 4 -2.1 GASeNPs 对体外羟基自由基的清除率分析 .- 4 -2.2 GASeNPs 对体外 ABTS+自由基清除率分析 .- 5 -2.3 GASeNPs 的总还原力测定分析 .- 5 -3 小结与讨论 .- 6 -参 考 文 献 .- 7 -致 谢 .- 8 -没食子酸纳米硒抗氧化性的测定I摘 要本文

3、通过采用分光光度法对没食子酸纳米硒（GASeNPs）体外清除羟基自由基、ABTS+自由基和还原力进行测定，评价其抗氧化性。结果表明，与没食子酸（Gallic acid,GA）、维生素 C(Vc)相比，100-300 g/mL的 GASeNPs 对羟基自由基的清除率为 49.90%-96.86%，其清除率高于同等浓度下的 Vc 及 GA；5-25 g/mL的GASeNPs 对 ABTS+自由基的清除率 47.02%-97.57%，其清除率高于同等浓度下的Vc 及 GA；20-100 g/mL的 GASeNPs 对还原力的测定吸光度为 0.362-0.911，在同等浓度下其还原力大于 Vc，略低于

4、 GA。实验结果显示，GASeNPs 具有较强的抗氧化活性。关键词：没食子酸纳米硒；抗氧化；自由基；清除率；还原力没食子酸纳米硒抗氧化性的测定IIAbstractIn this paper, the antioxidation of GASeNPs to hydroxyl free radicals, ABTS+ free radicals and reductive forces in vitro was determined by spectrophotometry with the Spectrophotometric method. The results showed that co

5、mpared with Gallic acid (Gallic acid,GA) and Vitamin C(Vc), 100-300 g/mL GASeNPs to hydroxyl radical scavenging rate of 49.90%-96.86%, its scavenging rate is higher than that the same concentration of Vc and GA; 5-25 g/mLGASeNPs to ABTS+ free radicals scavenging rate 47.02%-97.57%, its scavenging ra

6、te is higher than that the same concentration of Vc and GA. The GASeNPs of 20-100 g/mL to the determination of reducing power absorbancy is 0.362-0.911, in the same concentration its reducing power is greater than Vc, slightly lower than GA. The experimental results show that GASeNPs has strong anti

7、oxidant.Key words:gallic acid modified selenium nanoparticles; anti-oxidant; free radical; scavenging rate; reducing power没食子酸纳米硒抗氧化性的测定III引 言没食子酸(Gallic acid,GA),化学名 3,4,5-三羟基苯甲酸,是一种天然的多酚类化物,广泛存在于中草药和水果类植物中,包括叶下珠、五倍子、余甘子、葡萄、甜茶、报春黄甙叶等提取物 1。没食子酸具有抗炎、抗突变、抗氧化、抗肿瘤、抗自由基等多种生物活性,在食品、生物、医药、化工等领域有广泛的应用 2-3。硒

8、是动物和人体健康生长发育所必需的微量元素 4。纳米硒是纳米级的单质硒 5。硒的缺乏还会严重影响机体的抗氧化系统，造成对细胞膜、蛋白质和 DNA 的损伤，进而干扰各类激素、生长因子和细胞活性素在体内执行的各项功能 6。长期以来，关于硒的报道主要集中在纳米硒源和无机硒源作用比较和剂量确定上，大量实验证实了纳米硒比无机硒毒性作用低，生物转化率高 7。GASeNPs 具有较好的稳定性，然而对 GASeNPs 的抗氧化能力的评价还未见报道，对此本文选用 GASeNPs 作为研究对象，特别针对其体外其体外对各种自由基 (羟基自由基、ABTS +自由基及还原力的测定)的清除效果进行考察，并与 Vc 这个公认

9、的自由基清除剂和 GA 做对比研究，评估 GASeNPs 的抗氧化能力，以期为GASeNPs 抗氧化作用在食品保鲜、医药、化妆品等领域提供理论依据。没食子酸纳米硒抗氧化性的测定- 1 -1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 主要原料GASe 溶胶的制备参考已发表的文献进行 GASe 的合成制备 8。称取 0.19 g没食子酸至 250 mL 烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至 100 mL 容量瓶并用蒸馏水定容，配成 0.01 mol/L 的没食子酸储备液。称取 0.17 g 亚硒酸钠至 50 mL 烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至 10 ml 容量瓶并用蒸馏水定容，配成 0.1 mol/L 的亚硒

10、酸钠储备液。然后在 25 mL 烧杯中按 1：6 的浓度加入 Na2SeO3 与没食子酸，利用盐酸将 pH 调至 3.0后，加热挥干后得到橙红色固相样品。将此样品加蒸馏水溶解，在透析袋中过夜透析除去未反应的没食子酸后，定容于 10 mL 容量瓶中得到 GASe 溶胶。 1.1.2 主要实验试剂绿矾 分析纯 天津市永大化学试剂开发中心水杨酸 分析纯 天津市永大化学试剂开发中心磷酸氢二钠十二结合水 分析纯 天津市永大化学试剂开发中心双氧水 分析纯 天津市大茂化学试剂厂无水乙醇 分析纯 天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠二结合水 分析纯 天津市大茂化学试剂厂铁氰化钾 分析纯 天津市福晨化学试剂厂三氯乙酸

11、 分析纯 天津市福晨化学试剂厂过硫酸钾 分析纯 阿拉丁试剂（中国）有限公司ABTS 分析纯 上海源叶生物科技有限公司三氯化铁 分析纯 西陇化工股份有限公司1.1.3 主要实验仪器设备电子分析天平 奥豪斯国际贸易（上海）有限公司移液枪 Genex BetaCL3 型恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司石英比色皿 宜兴市伟鑫仪器有限公司低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂可见分光光度计 上海元析仪器有限公司没食子酸纳米硒抗氧化性的测定- 2 -数显恒温搅拌循环水箱 常州国华电器有限公司超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司干燥箱 上海跃进医疗器械有限公司1.1.4 试剂的配置6 mo

12、l/L 绿矾（ FeSO4.7H2O):称取 0.17 g 绿矾溶于烧杯中，并用蒸馏水定容于100 mL 容量瓶中摇匀。 6 mol/L 双氧水(H 2O2):称取 0.07 g30%的双氧水用蒸馏水定容于 100 mL 容量瓶中摇匀。 6 mol/L 水杨酸 (C7H6O3)：称取 0.08 g 水杨酸用无水乙醇溶解于烧杯中，并用无水乙醇定容于 100 mL 容量瓶中。 1 mg/mL 过硫酸钾：称取 0.10 g 过硫酸钾于烧杯中，用蒸馏水定容于 100 mL 的容量瓶中。 80%的乙醇：取 40 mL 无水乙醇加入到 50 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。ABTS 工作液：精密称取

13、40 mgABTS，加入 1 mg/mL 的过硫酸钾溶液 8 mL，密封后避光静置反应 16 h，定量转移到 250 ml 的容量瓶中，加入 32 mL 蒸馏水，用无水乙醇定容至刻度，放置 10 h 后使用。0.20 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=6.6）：甲液（磷酸氢二钠十二结合水），称取7.16 g 溶于烧杯中，用蒸馏水定容于 100 mL 的容量瓶中；乙液（磷酸二氢钠二结合水），称取 3.12 g 溶于烧杯中，用蒸馏水定容于 100 mL 的容量瓶中。取 40 mL 甲液，60 mL 乙液混合，即配置成所需的 0.20 mol/L 磷酸盐缓冲液。1%铁氰化钾 :称取 1 g 铁氰化钾溶

14、于烧杯中，加蒸馏水定容于 100 mL 的容量瓶中。0.1%三氯化铁:称取 0.10 g 的三氯化铁溶于烧杯中，用蒸馏水定容于 100 mL 的容量瓶中。10%三氯乙酸:称取 10 g 三氯乙酸溶于烧杯中，用蒸馏水定容于 100 mL 的容量瓶中。1.2 实验方法1.2.1 清除羟基自由基的测定1.2.1.1 实验原理根据 Fenton 方法产生OH 自由基的模型，H 2O2 与亚铁离子反应生成OH 自由基,该反应为：H 2O2+Fe2+OH+ OH+Fe3+没食子酸纳米硒抗氧化性的测定- 3 -自由基一般存活时间比较短而且具有较高活性的特点，而水杨酸能有效地捕捉羟基自由基且产生有色产物，因此

15、，若在该体系加入一定量的水杨酸，将发生颜色反应。生成的有色产物在 510 nm 处被较强地吸收。1.2.1.2 实验步骤 9-11（1）各取 1 mL 的 0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的样品溶液于 5 支离心管中，依次加入 6 mmol/L FeSO4 溶液 1 mL，6 mol/L H 2O21 mL，混匀后静置 10 min，再加入 6 mol/L 水杨酸溶液 1 mL 混匀后静置 30 min，然后于 510 nm 处测其吸光度值 Ai。在其他处理不变的情况下，以 1 mL 蒸馏水代替水杨酸测吸光度 Aj，空

16、白对照组以 1 mL 蒸馏水代替样品溶液测吸光度 A0。羟基自由基的清除率计算公式：E=(A0Ai+Aj)/A0（2）以样品浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标建立标准曲线，得出他们之间的关系。1.2.2 ABTS+自由基清除能力的测定1.2.2.1 实验原理ABTS 法是使用最广泛的间接检测方法，可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。ABTS 经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基 ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介质中，在 734 nm 处有最大吸收。被测物质加入 ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能与 ABTS+发生反应而使反应体系褪色，在 ABTS+的最大吸收波长（一般选择 734 nm

17、）检测吸光度的变化。1.2.2.2 实验步骤 12-13（1）各取 0.50 mL 的 0.005 mg/mL、0.010 mg/mL、0.015 mg/mL、0.020 mg/mL、0.025 mg/mL 的样品溶液于 5 支离心管中，用 80%乙醇补至 2 mL，再加入 2 mLABTS+工作液，摇匀，避光反应 6 min，然后在 734 nm 下测吸光值 Ai，在其他处理不变的情况下，以 80%乙醇代替样品溶液作为空白对照，测吸光度 A0。计算提取液对 ABTS+自由基清除率:W=(A0Ai)/A0没食子酸纳米硒抗氧化性的测定- 4 -（2）以样品浓度为横坐标，ABTS +自由基清除率为

18、纵坐标建立标准曲线，得出他们之间的关系。1.2.3 还原力的测定1.2.3.1 实验原理K3Fe(CN)6 (赤血盐）+ 样品K 4Fe(CN)6(黄血盐） +样品氧化物 K4Fe(CN)6+Fe3+Fe 4Fe(CN)63（普鲁士蓝）普鲁士蓝为沉淀，700 nm 是普鲁士蓝的最大吸收，在波长 700 nm 处测吸光度Ai，A i 越大，还原力越大。1.2.3.2 实验步骤 14-15（1）各取 1 mL 的 0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的样品溶液于 5 支离心管中，加入 0.20 mol/L 磷酸盐缓冲液 1.2

19、5 mL（PH=6.6）和 1%的铁氰化钾溶液 1.25 mL，混匀后于 50 水浴中保温 20 min 后，快速冷却，再加入 1 mL10%三氯乙酸，以 3000 r/min 的转速离心 10 min，取上清液 0.50 mL,加入 0.1%三氯化铁溶液 0.25 mL，再加入 1.75 mL 蒸馏水，充分混匀，在 700 nm 处测定其吸光值Ai。（2）以样品浓度为横坐标，吸光值 Ai 为纵坐标建立标准曲线，得出他们之间的关系。2 结果与分析2.1 GASeNPs 对体外羟基自由基的清除率分析没食子酸纳米硒抗氧化性的测定- 5 -图 1 羟基自由基的测定GASeNPs 对羟基自由基清除效果

20、由图 1 所示，100,150,200,250,300 g/mL 的GASeNPs 对羟自由基清除率分别为：49.90%、83.42%、91.35% 、93.36% 、96.68%。并呈现出一定的浓度依赖关系，而 Vc在相同浓度下的清除率分别为：40.42%、51.29%、52.94%、53.09%、53.20%,GA 的清除率分别为： 50.72%、62.82%、82.03%、90.58%、93.41%。结果表明 Vc 清除率较低，GASeNP 在相同浓度下对羟自由基清除率优于Vc 和 GA,最高清除率可达 96.68%。2.2 GASeNPs 对体外 ABTS+自由基清除率分析ABTS2,

21、2联氨双（3乙基苯并噻唑咻6 磺酸）二胺）是一种供氢体。该方法作为测定抗氧化性的一种新方法，以 Vc 为阳性对照，测定其清除率如图 2 所示。图 2 ABTS+自由基清除率的测定由图 2 可以看出，GASeNPs 对 ABTS+自由基的清除率随质量浓度的增加而增大，并呈现明显的量效关系。当质量浓度为 25 g/mL时，GASeNPs 的清除率为97.57%，GA 的清除率为 95.39%，而 Vc 的清除率只有 32.48%，可见 GASeNPs 对ABTS+自由基具有极强的清除能力。2.3 GASeNPs 的总还原力测定分析抗氧化剂的还原力与其抗氧化活性之间存在关系，还原力越强，抗氧化活性越强。FeCl3/K3Fe(CN)6 法测定还原力，是通过测普鲁士蓝沉淀在 700 nm 处的吸光度，而离心之后普鲁士蓝还没有沉淀下去时测其吸光度，吸光度处于不断变化之中，所以测量应先摇晃均匀放进去立马记录数据。