1、第四节 基因定位常用的方法l Wilson于 1911年将红绿色盲基因首次定位于 X染色体上 ,开创了人类基因定位的先河 .1968年,Donahue利用系谱分析的方法将 Duffy血型基因定位于 1 号染色体上 ,是人类首次在常染色体上进行的基因定位 .20世纪 70年代后 ,体细胞杂交重组 DNA、 分子杂交和 PCR等技术的出现和应用，基因定位的方法愈加先进，基因定位的速度、数量明显加快。人类基因组计划的实施和完成，更加促进了基因定位的进程。l 基因定位对提高人类对疾病产生的病因学的认识有重要意义。1明确几个基本概念基基 因因 ： DNA的功能片段。的功能片段。基因组基因组 ：有机体全部
2、：有机体全部 DNA序列（它包括基因序列（它包括基因 外的非基因外的非基因 DNA序列），它是基因和序列），它是基因和 非基因非基因 DNA序列的总和。序列的总和。基因定位基因定位 ： 是用一定的方法将基因确定到染是用一定的方法将基因确定到染 色体的实际位置。色体的实际位置。2l 遗传做图 ：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（ cM） 为单位。l 染色体定位： 只把基因定位到某条染色体上。细胞水平上的基因图又称 细胞遗传图l 区域定位： 从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下
3、观察，将基因定位到染色体的具体区带。3一、基因定位的方法l 1、体细胞杂交法基因定位：体细胞 ：即生物体除生殖细胞外的任一细 胞。1）体细胞杂交 的概念：也称细胞融合（ cell infusion）， 是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产生的细胞称杂种细胞（ hybrid cell）， 含双亲不同的染色体。42）对象 ： 人的细胞鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠3）杂种细胞的特点：在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色体，而啮齿类的染色体被保留下来。5l 4）原理：细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种
4、细胞。为此要 创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境 。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中 最常用的是 HAT选择系统 。6HAT选择系统：人的突变细胞株 ：缺乏 HGPRT酶小鼠细胞株 ：缺乏 TK酶两者融合培养于 HAT培养基中HAT培养基：H为次黄嘌呤，是 HGPRT的底物，为 DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）A可阻断正常的 DNA合成（嘌呤及 TMP合成受抑制）T在胸苷激酶（ TK） 的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为 DNA合成提供原料7因此在 HAT培养基上l 人细胞： 由于 A的存在，正常的 DNA 合成通路受阻 。 同时由于
5、HGPRT的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成 DNA（ 嘌呤合成障碍）8l 鼠细胞 ：由于 A的存在正常的 DNA合成通道受阻，有 HGPRT可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无 TK， 无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ）杂种细胞 ：有 HGPRT旁路合成腺嘌呤 ,鸟嘌呤；并可以利用 TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成）9l 将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养， 由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性 ， Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（ TK）。 凡是含有人 17号染色体的杂种细胞都因有 TK活性而存活，反之则死亡，从而推断 TK基因定位于 17号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。10
