在水产养殖系统中哈维氏弧菌的分子识别，打字和跟踪：目前的方法和未来的前景【文献综述】.doc

1、水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） 毕业论文 文献综述 生物 工程 在水产养殖系统 中 哈维氏弧菌的分子识别，打字和跟踪：目前 的方法和 未来的 前景 摘要 哈维氏弧菌 对 水产养殖 业 是一种有经济意义的 病原体，也是用于和鉴定，识别，追踪哈维氏弧菌的工具。 因此 ， 哈维有关人口的利益。 由于表型基因组的相似性和可塑性，传统的表型鉴定和分型方法并不总是能够解决从 与其 密切相关的物种 中得来的哈维氏弧菌。 这次审查提供了分子生物学方法的概述和评估 ， 目前 在分类学和流行病学研究 中 用于识别和 鉴定哈维氏弧菌的相关物种；并提出发展分子方法 的 前景和挑战 ，对

2、于 在复杂的样品 中哈维氏弧 菌 的直接检测。 关键词： 弧菌 ，弧菌病，物种鉴定，分子分型 ， 源追踪 内容 1.简介 2.哈维氏弧菌目前的 鉴定 和识别 的方法 2.1.表型的方法 2.2.分子生物学方法 2.2.1.全基因组分析 2.2.2.标记基因分析 3.在水产养殖系统中 哈维氏弧菌 的直接检测 前景 3.1.特定集群的检测方法 3.2.有毒 基因 的 检测 方法 4.结论 致谢 参考文献 1. 简介 哈维氏弧菌是一个氯化钠依赖的曲杆型塑造体，革兰氏阴性菌是由海洋环境中发现的（农民等，2005 年）。在 E.N 哈维提出这类菌种后，最初将其形容成为哈维氏无色菌（约翰逊和舒克， 193

3、6），在生物体发光系统研究的先驱领域，把后来的物种归属于卢奇细菌属（亨德里等， 1970）和贝内克氏菌属（ Reichelt 和鲍曼， 1973），最终将其定义在弧菌属和其家族群属中（鲍曼等， 1981） .模式水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） 菌株先前识别确认的种类弧菌属鲨鱼弧菌（ Grimes 等 ， 1985）和 竹荚鱼弧菌（岩本等， 1996）被确定为此类菌种的各变量（ V. harveyi）。哈维氏以分子基础研究为依据的专题论文中（彼得森等， 1998；Gauger 和 Gomez-chiarri， 2002；汤普森等， 2002），哈维氏弧菌被发现存在

4、于水生环境中非共生的自由生活状态并作为海洋动物的正常菌群的一部分（ Ruby 和莫林， 1979）。然而，在哈维氏菌群（ V. harveyi）中，哈维氏菌株已被认作为在海洋鱼类和甲壳类动物水产养殖中最重要的病原体（阿尔瓦雷斯等， 1998；张和奥斯汀， 2000；普哈尔特等 ， 2003； Zorrilla 等， 2003），包括对虾类（ Suranyanto和 Miriam,1986； Karunasagar 等 1994； Lavilla-Pitogo 等， 1998），和龙虾（贾瓦等， 1996；迪格尔斯等， 2000；伯恩等， 2006）。哈维氏弧菌对软体动物（ Pass 等， 19

5、87； Nishimori 等， 1998）和珊瑚（萨瑟兰等， 2004）的感染也有报道。 90 年代以来，哈维氏菌群（ V. harveyi）有关的感染对南美（阿尔瓦雷斯等， 1998）的大规模对虾养殖造成了严重的经济损失，甚至导致澳大利 亚（ Pizzuto 和赫斯特， 1995）和亚洲（ Jiravanichpaisal 等， 1994）的草虾和日本对虾在幼体阶段死亡率达 100%的情况也时常遇到。因此，在对虾类养殖中，这种疾病被描述为对虾弧菌病，对虾细菌性败血症， bolitas negricans（黑牛杆菌？），发光弧菌或红腿病。对弧菌病的症状反应包括嗜睡，组织和附属器官坏死，生长缓

6、慢，幼体变态缓慢和身体畸形，生物发光（虾在黑暗中发光），肌肉浑浊不透明， melanisation（黑化病？或者抑郁症？），空肠和厌食症（ Karunasagaret 等， 1994；罗伯逊等， 1998）。然而，有时候其他水产养殖品种的大规模死亡事件也和哈维氏弧菌有关系，包括新兴未开发的水产养殖行业（ Bourne等， 2004）。病原体已经被证明难以杜绝和抗生素的广泛使用在农场导致耐药菌株的发展（ Karunasa，噶尔等， 1994）。 哈维氏弧菌和它的相关种群本身并不认为对人类有害，但它能把非霍乱弧菌的多重抗药性转移到抗霍乱弧菌上，后者引起了 1991 年的拉丁美洲霍乱大爆发。然而，也

7、有报道人类中感染哈维氏弧菌的例子，美国东南岸的一个女孩在被鲨鱼袭击后感染了哈维氏弧菌，一个癌症患儿也被报道 在法国地中海游泳后感染这种细菌。 哈维氏弧菌的有毒 机制仍然没有 被 完全解 读 。 有毒机制对不同的宿主物种和品种差异似乎存在相当大的可变性 (Zhang and Austin, 2000; Conejero and Hedreyda, 2004; Bai 等人 ,2007; Austin and Zhang, 2006)。哈维氏弧菌的致病性 已经涉及到许多 的 因素 ，包括胞外产物 (ECP)的 分泌， 含有的物质 例如： 蛋白酶，溶血素和脂肪酶 (Harris and Owens,

8、 1999; Liu and Lee, 1999; Zhang and Austin, 2000; Teo 等人 , 2003), 多脂糖 (Montero and Austin, 1999), 和细菌类物质 (Prasad 等人 , 2005).此外，发光 (Manefield 等人 , 2000),群体感应 (Henke and Bassler, 2004), 生成赋有阻力的生物膜的能力，对 消毒剂和抗生素 (Karunasagar 等人 , 1994),噬菌体感染 (Oakey and Owens, 2000), 蔗糖发酵 (Alavandi 等人 , 2006),和结合铁的 能力 (O

9、wens 等人 ,1996)全部都与毒力有关联。另外，环境因素也被证明，例如：温度和盐度的变化，同样在哈维氏弧菌介导的弧菌病中起一水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） 定的作用 (Alavandi 等人 , 2006)。 由于哈维氏弧菌感染在经济学的重要性，这里有相当大的兴趣，对于鉴定、识别、跟踪哈维氏弧菌相关群体与海洋饲养动物的关联方法。哈维氏弧菌菌株的鉴定可以是一个有挑战性的任务，因为包含于哈维分支 (哈维氏弧菌 , 坎氏弧菌 ,rotiferianus 弧菌， 溶藻弧菌 ,副溶血性弧菌 , 肋生弧菌 和 需钠弧菌 )中的物种具有一种高程度的遗传和表型相似 性 (

10、Sawabe 等人 , 2007)。 细菌分型系统在 菌 株的表型或基因型特性 中 检测差异 ， 并根据他们的分辨能力来区分属 、 种或品系 。 因此，细菌分型系统 是 细菌分类学和流行病学 的集成的形成基础。对于 流行病学研究 ， 病原追踪 是关系重大的， 关注一种疾病 的 生态自然历史 ;或疾病控制计划 的 规划，监测和评估。病原追踪的 方法包括识别和输入 的 方法 ， 以及有关生物体直接检测和定量 的 方法 ， 在环境样品 中 。 本文综述和评估了当前 对哈维氏弧菌相关物种的鉴定识别 的方法 ， 并讨论了发展分子生物学方法 的 前景和挑战 ， 对复杂的样品 中哈维氏弧菌 的直接检测 。

11、在 审查补充不久前出版的 出自 Owens and Busico-Salcedo(2006)的 一章，其中详细 报道了哈维氏弧菌介导 弧菌的 流行性动物传染病，哈维氏弧菌鉴定的 传统方法， 哈维氏弧菌 不同的致病因子，并 针对 商业水产养殖孵化场讨论流行病学和可能的控制措施。 2. 哈维氏弧菌目前的鉴定识别方法 细菌 识别 系统 通过检测其特性的差异来 区分属 、 种或品系。 通过菌种识别 ，分类学家已经 能够阐明 哈维氏弧菌及其相关物种的发展进化史 (Thompson 等人 , 2005, 2007)。 哈维氏弧菌的识别也已是 小规模的流行病学研究 的 目标 ，用来在 单 一机构和 体系中描

12、述与某些动物宿主有关的亚群体毒性(Pizzuto and Hirst, 1995; Pujalte 等人 , 2003; Alavandi 等人 , 2006)。 对于哈维氏弧菌 鉴定 在 水产养殖系统 中， 理想细菌 识别 系统 的特性是高歧视性，高识别性 （一个 可被识别 类型菌株的比例），高重复性，便于 表现 ，成本低 。 对于哈维氏弧菌相关的物种，然而因为菌株在其表型和基因型中是高度相似，强劲的歧视性识别工具的发展是很困难的 (Gomez-Gil 等人 , 2004)。 此外，在个体菌株随时间时间推移中，通过改变其表型和 基因型，重复性是可以被限制的（基因组的可塑性）。多种多样的遗传事

13、件参与于进化过程中，例如：突变 (Thompson 等人 , 2004a), 染色体重组 (Makino 等人 , 2003),复制 (Zhang 等人 , 2001),噬菌体感染 (Owens and Busico-Salcedo, 2006),和水平基因转移 (Tagomori 等人 , 2002)可能是负责在哈维分支的成员中进行表型转化。被提供的最好例子是当 Vidgen 等人 (2006)通过哈维氏弧菌似肌尾病毒 (VHML)导致表型特征被修改的噬菌体，发现了 一套感染的哈维氏弧菌菌株，包含的差异在于 D-葡萄糖的利用， -谷氨酰转移 ，和硫酸酯酶活性 ， 从而通过生化实验降低了他们身

14、份证明的保障级别 。 在这一节 中， 我们将 展现 现有的表型和分子生物学方法 在哈维氏弧菌上的鉴定与识别，伴随注水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） 重 每个方法的原理，他们的优点和局限性，以及它们在 哈维氏弧菌 及相关品种研究 中 使用的例子。 2.1. 表型的方法 弧菌鉴定识别的传统方法是基于表型方法，例如： 新陈代谢或脂肪酸分 析，血清学方法， 分析抗菌药物的敏感性。这些方法从不同品种和品系 中 描述和比较产品的基因表达。 如上所述，鉴别度的表型方法被哈维氏弧菌菌组所限制，因为他们高度相似的表型。此外，基因组的可塑性可能导致表型变异，并因此影响重现性的表型分析

15、。 生化试验通常被用于哈维氏五的鉴定，并且许多实验室使用特定的项 (e.g. Alsina and Blanch, 1994a,b)用于常规鉴定的弧菌菌株。市售标准化系统是 API 20E (bioMerieux, Inc. Marcy lEtoile, France) 和 Biolog GN (Biolog Inc., Hayward, CA, USA)，它是 根据碳源利用模式 在 革兰氏阴性菌菌株鉴定 中， 可以媲美一个数据库 的 已知生物， 及 分配的最佳匹配。这些测试很容易执行， 一应俱全， 而且 其成本 也 相对较低。脂肪酸分析（ FAME）的是一种替代生化方法 ，即是其中 脂肪酸甲

16、基酯型材的细菌菌株进行了比较。 然而有些作者认为，哈维氏五相关的物种可以通过比较生化指标概况来区分 (Kita-Tsukamoto 等人 , 1993; Alsina and Blanch, 1994a,b; Harris 等 人 , 1996)，这些物种的其他研究表明，表型测试缺乏分辨能力， 某些类型的物种群集在一起，留下一些非集群或身份不明 的 菌株 (Lambert 等人 , 1983; Vandenberghe 等人 ,1999; Hisbi 等人 , 2000)。更具体地说，哈维氏弧菌和他的姐妹 坎 贝 氏弧菌 和 rotiferianus弧菌有几乎难以区分的表型，而且错误鉴定时有发

17、生 (Gauger and Gomez-Chiarri, 2002; Gomez-Gil 等人 , 2004)。后者的研究受分子生物学方法（参见 2.2）支持并结论得出：普 遍误认的 坎 贝 氏弧菌 和哈维氏弧菌可能会低估 坎 贝 氏弧菌 作为一个重要致病菌的海洋养殖生物。事实上，最近的研究已经证实 坎 贝 氏弧菌 和 rotiferianus弧菌两个都对海洋鱼类及甲壳类动物有致病性 (Austin 等人 , 2005; Defoirdt 等人 , 2007a)。 血清学方法 对 生化试验提供 了 一种替代方法 ，用于 在水产养殖系统 中 哈维氏弧菌的鉴定。酶联免疫吸附试验（ ELISA） 是

18、 基于多克隆抗体 基础上， 为哈维氏弧菌菌株的快速鉴定 而被开发出来的 ，但是 已观察到 它及其 相关的物种 有 交叉反应 (Robertson 等人 , 1998)。 Phianphak等人 (2005)培养 单克隆抗体 用于对虾组织中哈维氏弧菌的检测， 不过，这项试验还表明 哈维氏弧菌 与其他革兰 氏 阴性菌 有 交叉反应 ，而且 这项研究并没有包括 将 一些重要的密切相关的物种作为对照组。血清学方法 的缺点是：必要的抗体并不普遍，除了质量控制外都是既费时又费钱。 最后， 抗生素敏感性分析已被用在流行病学研究 中， 在抗生素抗药性的条款 中描述 已经确定 的哈维氏弧菌致病 菌 株 (Abr

19、aham 等人 , 1997; Musa 等人 , 2008). 2.2. 分子方法 总的来说， 分子生物学方法 与 表型试验比 总结起来有 较高的鉴别力 和 较高的重现性。 这些优势是一个他们能力的结果，用于发现小基因组的差异和分子靶点的更高稳定性，相较于表现性的配置水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） 文件，对于某些物种 (Sethi 等人 , 1996;Tenover 等人 , 1997)。 然而，对于哈维氏弧菌相关的物种，高度相似的基因组和基因组的可塑性也可能在某些情况下用过分子技术限制精确识别 (Thompson and Swings, 2006; Sawa

20、be 等人 , 2007)。 一系列不同的分子生物方法已被用于与哈维氏弧菌相关物种的鉴定识别。 对 具体研究最合适的工具将取决于数量 和 针对性菌株 的 多样性，本研究（鉴定，检测或特性）的目标，和 本次 研究的空间和时间尺度。不同的分子生物学方法鉴别力差别很大，性能和成本的 便捷 和速度也是如此。这项决定 ， 使用分子技术，相对于一个特定的表型方法 ，应该有一个简便性、必要性的比较，对于高通量的分析成本，用 来得体的回答这个被问的问题 (Riley, 2004)。在某些情况下，例如在农场中的常规鉴定与检测，速度可能作为另一种标准来 考虑。对 哈维氏弧菌 及其 相关物种 ， 表 1总结 了 在

21、整个基因组的适用性和指纹的方法 ， 并 将 包括哈维氏弧菌 及其 相关物种 的 已发表的研究 报告作为根据。 表 1 用于哈维氏弧菌相关物种的鉴定和区分的全基因组和分子指纹图谱识别方法 2.2.1. 全基因组分析 DNA - DNA 杂交（ DDH） 在两细菌 菌株 间评估其 DNA 相似性 ，并且这 一直被视为细菌物种 划界的黄金标准技术。 这种方法也可以被用于一个含模糊属性菌 株的权威分配，到正确的分类单位 (Wayne 等人 ,1987)。虽然， DDH 被新细菌物种的提案所需要，他并不适合菌株的常规鉴定，因为这项技术是复杂的，仅限于少数实验室且非累积性的，还要求在每个鉴定项中包含参考菌

22、株 (Gevers 等水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） 人 ,2005)。 然而，最新的进展已经将这个技术带入一个微阵列平台 (Cho and Tiedje, 2001)， 如果标准基因组芯片 对细菌是可用的， 这种方法 可被用于一个杂交概况的开放式数据库。现代的弧菌生物分类是以表型特征被定义，并由 DDH 实验做进一步验证。而 70的 DNA- DNA 相似性 已普遍 被用来作为 属于同一物种菌株的 标准 ， 80的 DNA- DNA 相似性 则被推荐作为在家庭弧菌中的物种定义限制(Thompson 等人 , 2004a)。 戈麦斯吉尔和 他的 同事 门 (20

23、04)利用 DDH 实验用来准确标识与 哈维氏弧菌 相 关的 39株假定的 菌株 ，作为 哈维氏弧菌 、 坎贝氏弧菌 和 rotiferianus 弧菌 ，并表明这三个密切相关的物种 共 享 N65的 DNA- DNA 相似性。 由于劳动密集型协议和包含在执行 DDH 分析的成本，若干 项研究已经 对 全基因组指纹识别技术作为物种分类 的 替代方法 的潜力进行了 评估 。这些方法也被 用于细菌的制约群体的鉴别，在流行病学研究中，例如从哈维分支中取得的菌株。到目前为止， 三 个 全基因组指纹识别技术已用于哈维氏弧菌 相 关物种 及菌 种 的 分析：扩增片段长度多态性 技术 （ AFLP） ， 重

24、复基因外回文元素 的 聚合酶链反应 技术 （ REP- PCR） 和 随机扩增多态性 DNA 技术（ RAPD）。 AFLP是基于 片段扩增的 分离模式 的大小，并 伴随 两个引物 对在 基因组 DNA的 最初限制性切割 后 。总的来说，每一个细菌物种都有各自特定的 AFLP 技术模式。 由于通过 DDH 使其获得良好的分组对应，这项技术可以被用来作为另一种细菌鉴定工具 (Janssen 等人 ,1996)。对于弧菌， DDH 的相似之处可以从 AFLP 技术相似性 中预见，对于大约 80 100%的 DDH 相似度需 对应 70%左右的段带成对相似性(Thompson and Swings,

25、 2006)。弧菌菌株聚集在 45%的 AFLP 技术模式 相似度就被认为属于同一品种(Thompson 等人 , 2001)。 REP-PCR 利用 PCR 扩增引物来 扩增 存在于 基因组内多个副本 中的 高度保守的 DNA 序列 。在凝胶基质中解决扩增产物后， REP-PCR 指纹识别技术被建立并用来区分细菌菌株，在物种和菌株水平上 (Versalovic 等人 , 1991)。最后， RAPD 技术是以 基因组 DNA 片段 的 随机扩增为基础， 采用任意核苷酸序列 的 单个引物 。产生片段的分离尺寸允许 在基因上不同的克隆系列间有差异。 该技术 是 快速 的 ，简便 的 ，价格低廉

26、的，尽管它患有较差的重复性，由于引物的目标网站随机性 (Grtler and Mayal, 2001)。 全基因指纹识别方法已被用在若干研究中，用于完善复杂的哈维氏弧菌的分类，并查明与海洋动物疾病相关的菌株。 AFLP 作为一个对哈维氏弧菌相关物种的 鉴定工具 有许多重要的优点，包括AFLP谱带类型对弧菌的高重 复性价值 (91 3%)，数据在数据库中积累便易， 和高歧视率 (Thompson 等人 , 2001)。 戈麦斯吉尔等 人 (2004)，对于 哈维氏弧菌 、 坎贝氏弧菌 和 rotiferianus 弧菌 ， 报道了DDH 的数据与 AFLP和 REP-PCR 的指纹识别模式，从而

27、 证明这两个指纹 识别 技术对哈维氏弧菌相关物种 的 可靠鉴定的价值。 在另一则研究报告中，形同的作者用 REP-PCR 技术来区分与 哈维氏弧菌 相关的自墨西哥西北部发现的玫瑰 笛鲷 (Gomez-Gil 等人 , 2006)。综上所述，这项技术与弧菌受到歧视密切相关， 像哈维氏弧菌、 溶藻 胶弧菌 、 坎贝氏弧菌 、 副溶血弧菌 、和 rotiferianus 弧菌 , 而且也水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） 提出了四个潜在的新型弧菌物种的存在。 流行病学研究已用全基因组指纹识别方法来联营特定的谱带于特定的病原株或克隆 (Wassenaar, 2003)。举例

28、来说 , Vandenberghe 等人 (1999)利用 AFLP 指纹识别图谱来描述弧菌，那些弧菌关系到在厄瓜多尔的南美白对虾的对虾弧菌病的爆发，和 正与疾病相关的 哈维氏弧菌的 后期幼体 、 幼虫和性成熟个体 的菌株。 RAPD 指纹识别图谱能够被用于哈维氏弧菌菌株中强毒株和弱毒株间的区分，在一些寄主身上。 (Pizzuto and Hirst, 1995; Hernandez and Olmos, 2004; Alavandi 等人 , 2006)。在一些研究中， 这项技术可以让分离的菌株集群，菌株是从相同的动物品种，甚至是属于不同疫情或不同饲养系统中获得的。 (Pujalte 等人

29、, 2003; Musa 等人 , 2008)。因此，在流行病学中， RAPD 技术常常被作为首选方式，用于在弧菌病爆发期间识别新出现的病原体和哈维氏弧菌的来源追踪。但是，这个方法 被报道说 对哈维氏弧菌的 区分力相对较低，与一些核糖分型协定相 比较。 (参见 2.2.2) (Macian 等人 , 2000; Pujalte 等人 , 2003)。由于其引物站点目标的随机性和特定引物对 于开启 DNA 合成 并且复制产生一定数量的 DNA 片段的效率 ，该技术同样具有不可重复性 (Tenover 等人 , 1997)。用过分类学分类的使用， RAPD 技术应该被辅之以一种更具准确性和的重现性

30、识别工具 (Grtler and Mayal, 2001)。 尽管全基因指纹识别方法对菌种的鉴定和描述有用处，这个技术仍然有其局限性。相较于其他分子方法，如 PCR 检测，他们都相对比较费时 ，昂贵，而且对于谱带类型需要较高的技术技能。 哈维氏弧菌的基因组可塑性也可能导致谱带类型的变异，从而影响到指纹识别图谱的可重复性。此外，这项技术的高分辨度也意味着在不同的研究中谱带类型可能不能直接比较尽管全基因指纹识别方法对菌种的鉴定和描述有用处，这个技术仍然有其局限性。相较于其他分子方法，如 PCR 检测，他们都相对比较费时，昂贵，而且对于谱带类型需要较高的技术技能。 哈维氏弧菌的基因组可塑性也可能导致

31、谱带类型的变异，从而影响到指纹识别图谱的可重复性。此外，这项技术的高分辨度也意味着在不同的研究中谱带类型可能不能 直接比较 。 2.2.2. 标记基因分析 为了哈维氏弧菌的检测和鉴定，多位点的适应性作为系统进化的标记基因被追究。而有些作者建议针对单个基因 (Conejero and Hedreyda, 2003; Oakey 等人 , 2003; Pang 等人 ,2005)，其他人则认为用多种方法对哈维氏弧菌的紧缺识别是很必要的 (Sawabe 等人 , 2007; Thompson 等人 ,2007)。 2.2.2.1. 单基因座分析 大多数 对 哈维氏弧菌检测和鉴定 的 检测 都 基于单

32、基因 来 依靠最初的 PCR扩增 ，在某些情况下，实验包括基因测序或限制性内切酶酶切介绍的分析。 PCR引物，被设计为哈维氏弧菌基因的特定扩增，载列于表 2。 核糖体 （ Ribosomal） 基因序列 水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） 对于细菌细胞的存活能力， 16S和 23S核糖体 RNA是必需的， 因此他们的基因编码是高度保守的。然而，这些基因也包含对在家族水平中 微生物种群的表征和区别有用的短变量序列， 在许多属种水平情况下。这种保守变异的位点组合，通过 PCR扩增和基因测序，是这些分子成为识别弧菌的理想生物分类指标 (Kita-Tsukamoto 等人

33、, 1993)。 16S的 rRNA基因被认为是弧菌系统发育的标准标记，虽然因为该基因进展 缓慢，物种间的差异被限制，因此，常常无法解决密切相关的细菌菌株 (Nishibuchi, 2006; Nagpal 等人 , 1998)。 在哈维氏弧菌的情况下，他往往难以解决这一物种，从弧菌核心小组的其他物种中 (溶藻胶弧菌 , 坎贝氏弧菌 , 副溶血弧菌 , 和 rotiferianus弧菌 ) ，完全基于 16S rRNA基因的异质性。比方说，哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌和 rotiferianus弧菌的物种对于 16S rRNA基因有超过 99% 同源性 (Gomez-Gil 等人 , 2003)。不

34、过一些 PCR引物对是专门为特定哈 维氏弧菌的 16S rRNA基因扩增所设计 (表 2)。 Oakey 等人 (2003) 开发了一套 PCR 协议， 只为哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌产生扩增产物，而且通过一个单一的生化实验，这些物种能够被明确的区分。应该注意的是，尽管该项研究没有为包含的坎贝氏弧菌菌株扩增出一个产物， 引物特异性的计算机模拟分析显示引物对 (VH-1, VH-2)没有错配，用坎贝氏弧菌 (基因序列数据库登录号 X536575)和 rotiferianus弧菌 (基因序列数据库登录号 AJ316187)的数据库序列。 最近 , Gauger and Gomez-Chiarri (2

35、002) 报道了哈维氏弧菌类型菌株 ATCC 14126T (基因序列数据库登录号 X74706)在数据库中的 16S rRNA序列中的一个错误。根据这些资料， Fukui and Sawabe (2007, 2008)重新分析了哈维氏弧菌的 16S rRNA基因序列，为特定物种的常规 PCR鉴定设计了新型引物 , 而且不同的引物与某一 TaqMan荧光探针 （ 一种寡核苷酸探针 ； RNA探针 ）结合用于某一特定物种即时的 PCR 检测。而 TaqMan荧光探针 区别 哈维氏弧菌和与其密切相关的物种，用于 与坎贝氏弧菌和rotiferianus弧菌实时检测的引物没有错误匹配 ,，在坎贝氏弧菌

36、或 rotiferianus弧菌的高丰度存在中，导致哈维氏弧菌丰度的估计不足。 (参见 3.1)。 核糖分型 核糖分型或者核糖体 RNA限制性片段长度多态性分析 技术 (rRNA-RFLP)是基于内部或旁侧的 16S, 5.8S 和 23S核糖体 RNA基因的序列差异检测。该技术已广泛应用于哈维氏弧菌相关物种的鉴定 和流行病学的研究 (Macian 等人 , 2000, Pujalte 等人 , 2003; Montes 等人 , 2006)。 根据所用探针和限制性内切酶 的 目标 区域 ，这一技术可能 有 足够的分辨率 用于哈维氏弧菌不同菌株间的区分。最近，核糖分型的商业可用平台， 全自动微

37、生物基因指纹鉴定系统 (DuPont-Qualicon, Wilmington, Delaware, USA), 已经激发了核糖分型的新一轮热潮。 该仪器自动执行程序 的 所有步骤并生成标准的电子指纹图谱 ， 电子指纹图谱可整合到一个共同的数据库。 Pujalte 等 人 (2003)将这个平台用于类型 47哈维氏弧菌菌株 , 其中分为 15种不同的 核糖分型。总的来说 ,随着时间的推移，核糖分型指纹水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） 图谱被认为是非常重复稳定的，而且这方法对流行病学研究有用处。 扩增核糖体 DNA 限制性分析（ ARDRA） ARDRA技术是一种指

38、纹图谱识别方法，基于 PCR扩增核糖体 RNA基因的限制模式。 Urakawa 等人 (1997) 用这种方法于 范围广泛的弧菌物种基因型， 然而研究表明 ，哈维氏弧菌相关的菌种有溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、坎贝氏弧菌、 解蛋白弧菌 和 创伤弧菌 (生物型 I)，他们即使用五种限制性内切酶也无法被解决。相同地， Hernandez and Olmos (2004)获得了一个单一条带，当试图区分 15个环境弧菌菌株。在这两项研究中，扩增片段局限在 16S rRNA基因中，这表明 16S rRNA基因根据 ARDRA技术对哈维氏弧菌菌株的鉴定目的及流行病学研究没有作用。然而， ARDRA技术以 rRN

39、A操纵子的大部分为基础能有较高的分辨率，这是可能的，尽管这可能去要实验验证。 ToxR基因 toxR 基因最初是在霍乱弧菌编码中被描述的 跨膜转录调节因子 ToxR ，霍乱弧菌毒性操纵子的管路基因 (Miller and Mekalanos, 1984)。虽然在某些弧菌菌种中的 toxR 基因控制胞外重要致病因子的表达，该基因也被描述为非致病品种，而且作为一个监管基因，对于外膜蛋白基因的表达，其功能更为广泛 (Okuda 等人 , 2001)。在各类弧菌品种中， toxR 基因的存在或是迄今报道的 其中一个内部部分 (Reich and Schoolnik, 1994; Kim 等人 , 19

40、99; Okuda 等人 , 2001; Pang 等人 , 2005; San Luis and Hedreyda, 2005)。 该基因在弧菌中似乎非常保守，虽然，它另外还具有潜在有用的高度分歧区域，用于对特定物种的弧菌鉴定开发 PCR 引物 (Kim 等人 , 1999)。由于其同时存在于两个致命与非致命的物种中， toxR 出借 自身 作为一个潜在的品种特异性标志 而 不是作为一个致病标记。 表 2 哈维氏 弧菌基因 特定扩增设计的 PCR引物 基因 基因产物 引物名称 引物序列（ 5 3） 产物长度（ bp） 参考资料 16S rRNA gyrB toxR Vvh 16S 核糖体 R

41、NA Subunit B of DNA gyrase Transmembrane transcriptor regulator Haemolysin protein VH-1 VH-2 VHARF VHARR A2 B3 Vh_toxR-F Vh_toxR-R toxRF1 toxRR1 VHF1 VHR1 VhhemoRa AACGAGTTATCTGAACCTTC GCAGCTATTAACTACACTACC CCGCATAATACCTACGGGTC ACCCGAAGTGCTGGCAAACA TCTAACTATCCACCGCGG AGCAATGCCATCTTCACGTTC TTCTGAAGCA

42、GCACTCAC TCGACTGGTGAAGACTCA GAAGCAGCACTCACCGAT GGTGAAGACTCATCAGCA ATCATGAATAAAACTATTACGTTACT GAAAGGATGGTTTGACAAT GCTTGATAACACTTTGCGGT 1300 967 363 390 382 1257 308 Oakey 等人 (2003) Fukui and Sawabe (2007) Thaithongnum 等人 (2006) Conejero and Hedreyda (2003) Pang 等人 (2005) Zhang 等人 (2001) Conejero and

43、水产养殖 -卷 287， 2009 年 2 月 （ 1-10） luxN Receptor of LuxM/N quorum sensing system uxN rluxN CTGTGTACTCACTGTTTATC GTCTAATTCGCGTTCTCCA 2048 Hedreyda (2004) Bassler 等人 (1993) 用 引物 VHF1使 308 bp长度的扩增产物结合。 对于哈维氏弧菌 , 为哈维氏弧菌 toxR基因的特异性扩增所设计的两对 PCR引物 (表 2)。 Conejero and Hedreyda (2003) 将从哈维氏弧菌中提取的 toxR基因克隆并测序，在一

44、对变质的引物最初的扩增后 (Osorio and Klose, 2000)。根据该序列和从其他弧菌中提取的公开使用的 toxR序列，这些作者为哈维氏弧菌特定的 toxR扩增设计引物。但是，验证试验对两个哈维氏弧菌菌株产生假阴性结果(VIB 391 and STD 3-101)。有趣的是，这两个菌株属于一个独立 AFLP的哈维氏弧菌集群，而且分离自虾而不是鱼。 Pang 等人 (2005)设计了多种哈维氏弧菌特定的 toxR PCR引物，该引物对坎贝氏弧菌和 解蛋白弧菌 的参考菌株并不扩增。然而，这项研究的对照既不包括哈维氏弧菌 STD 3-101也不含rotiferianus弧菌，并且需要进一

45、步研究来 验证这些 引物的特异性。 gyrB基因 该 gyrB 基因编码的 DNA 旋转酶（拓扑异构酶 II 型） B 亚基蛋白 。 Haithongnum等 人 (2006) 针对这种对哈维氏弧菌检测基因，通过对 40 株中的 36 株哈维氏弧菌菌株进行特异性扩增（ 用生物化学分析作为区别 ） ， 设计了 PCR 操作。据报道该 PCR 操作对于测试所有其他弧菌是不起作用，这些弧菌中包括了 坎贝氏弧菌 ATCC 25920。 通过结合使用 最大或然数法 （ MPN）富集技术， 从虾人工接种数中 枚举出高达 15 细胞 /毫升，然而最近分类学研究报道称通过对大量的哈维氏弧菌和 坎贝氏弧菌 进行

46、研究，显示 gyrB 基因缺乏分辨这两个菌种的能力，而将它们聚集在一起 (Thompson 等人 , 2007)。 因此，在被 接受为真正的特异性种属之前， 似乎有必要对 哈维分支中的所有物种，包括最近描述 的 rotiferianus 弧菌 ，进行大量的株菌测试。 勒克斯 （ Lux） 基因 哈维氏弧菌群体感应系统最近被重新审查 （ 弥尔顿， 2006年 ; Defoirdt等人， 2007b） ，而现在我们将只关注与分子分型鉴定和相关工具的开发有关的方面。 在哈维氏弧菌中，三个 细胞信号转导系统在 平行运作， 每生产一个独特的 自体诱导物 涉及多基因对于 细菌密度的表达 (Bassler等

47、人 , 1993)。 在这个物种中，群体感应已经与控制生物发光 (Bassler 等人 , 1993; Manefield 等人 , 2000)，生物膜形成（ Hammer and Bassler, 2003）， III型分泌（ Henke and Bassler, 2004），蛋白酶（ Mok 等人 , 2003），和铁载体生产 (Lilley and Bassler, 2000) 联系在一起。信令系统 LuxM/ N被证明是哈维氏弧菌和与弧菌密切相关的物种所特有的 (Bassler 等人 , 1997)，因此，它可用来调查 自体诱导物的 信号受体 LuxN和 自体诱导物的 合酶 LuxM的 编码基因是否可作为物种特异性标记基因 (Hernandez and Olmos, 2004)。 Hernandez and Olmos (2004) 设计特定扩增的 luxN基因的 PCR引物 ，