《抗疟药使用规范》编制说明.doc

1、1巴贝虫检测 虫种核酸鉴定法编制说明一、 任务来源与项目编号、参与协作单位、简要起草过程、主要起草人及其所承担的工作等本项目为 2016 年度国家卫生和计划生育委员会下达的寄生虫病标准制（修）订任务，项目编号为 20160305，主持单位为中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，参与协作单位为复旦大学，第二军医大学。接受标准制定任务后，积极认真开展以下工作。（一） 组成标准编制专家工作组2016 年 1 月 26，根据项目申请书提出的 6 人工作组，成立由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所刘琴研究员、周晓农研究员、张仪研究员，陈家旭研究员和复旦大学胡薇教授及第二军医大学朱淮民教授组成的 6

2、 人工作组，召开标准编制专家工作组会议，学习与研究了标准制订的相关文件精神与要求，参阅了相关标准和有关专业文献资料，工作组讨论制定工作计划及时间表，制定了标准研究的方法与技术路线，并进行分工。2016 年 3-4 月，刘琴研究员开展预备实验，对核酸检测技术进行实验性研究，获得实测数据后，进行分析，进一步确定技术方法与操作步骤。2016 年 5 月，根据预备实验的数据和操作程序，工作小组起草标准初稿。（二） 形成标准“工作组讨论稿”2016 年 6-7 月，工作小组对标准初稿进行讨论，工作组组员对实验的数据和操作程序经过认真激烈的讨论，归纳、分析与概括，2形成标准“工作组讨论稿” 。（三） 形成

3、标准“征求意见稿”2016 年 10 月，根据工作计划，邀请了上海兽医研究所、复旦大学、中国疾病预防控制中心、海南省疾控中心、福建省疾控中心等单位周金林、王善青，李莉莎等 19 名专家在海南省三亚天涯区召开标准的第一次专家研讨会，听取专家意见，根据专家意见，标准编制专家工作组对标准的前言、正文和附录部分逐条进行了讨论研究和修改，形成标准征求意见稿第一稿。2016 年 11-12 月，以征求意见第一稿为模板，开展比对试验，进一步完善征求意见第一稿。2017 年 1 月，邀请了复旦大学、上海交通大学、上海兽医研究所、中国疾病预防控制中心、瑞金医院、浙江省寄生虫病研究所、苏州市疾控中心等单位王敬文、

4、华修国等从事巴贝虫病教学、科研、疾控和医疗单位 21 位知名专家在上海召开标准的第二次专家研讨会，根据专家意见，标准编制专家工作组对标准的前言、正文和附录部分逐条进行了讨论研究和修改，形成标准征求意见稿第二稿。（四） 形成标准“送审讨论稿”2017 年 1-3 月，在完善的征求意见第二稿的基础上更大范围内听取华中农业大学、兰州兽医研究所、瑞金医院、华山医院、浙江省疾控中心、复旦大学、南方医科大学、广东省疾控中心等单位赵俊龙、关贵全等 26 名专家们书面意见，起草小组对收集的意见进行了汇总，共收集了 67 条重要的意见，起草小组对专家提出的意见逐条进行了研究，并根据书面意见对标准征求意见第二稿进

5、行了细致3的修订，形成标准“送审讨论稿” 。二、 与我国有关法律法规和其他标准的关系本标准参照并遵循卫生部颁布的相关规定，根据中华人民共和国传染病防治法的要求制订，按照 GB/T 1.12009 的要求编写。本标准起草参照了 2016 年 12 月 15 日批准的中华人民共和国行业标准WSXXX-2015 巴贝虫病诊断 。三、 国外相关法律、法规和标准情况的对比说明美国、法国、葡萄牙、意大利、波兰、挪威、埃及、墨西哥、澳大利亚、日本、巴基斯坦及南非等地均有田鼠巴贝虫病报道，呈地方性流行。在美国，人群田鼠巴贝虫病在非疫区、低风险地区以及疫区的血清学阳性率分别为 0.025%-0.75%，0.4%

6、-0.84%以及 1.14%-1.53%。美国 FDA 的统计结果表明，从 1997 年起，因输血传播田鼠巴贝虫死亡的病例达到数百例，近年来，这一数据仍在急剧上升。田鼠巴贝虫已被美国 FDA 作为血液制品的强制性检测指标之一。对血清学筛选，首选方法有间接免疫荧光实验（IFA） ，其具有敏感快速的特点。但对田鼠巴贝虫虫种鉴定，血液涂片显微镜检查和核酸鉴定仍然是标准方法。但是，显微镜下，常常不能很好的区分田鼠巴贝虫与疟原虫及其他巴贝虫和泰勒虫。并且，寄生虫血症密度常很低，这种方法需熟练的显微镜技术员操作；症状轻微的亚临床感染者由于寄生虫血症密度极低而在镜下很难观察到病原体，溶血和治疗会导致虫体破碎

7、、变形而难以辨认。因此，核酸分子技术为其4虫种的快速鉴定提供了可能。在中国，目前还没有关于人巴贝虫的虫种鉴定的标准，因此，建立本标准迫切需要。四、 标准的制定、修订与起草原则在本标准制定过程中，起草小组根据国内外巴贝虫虫种核酸鉴定的现状和发展趋势，结合我国巴贝虫病流行特点和国情，本着方便实用，因地制宜且能标准化使用的原则，规定了人巴贝虫的检测和巴贝虫虫种核酸鉴定。本标准制定、修订与起草原则是适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测和虫种鉴定，其实验能在各级疾病预防控制机构和医疗机构操作方便，结果容易判断。五、 确定各项技术内容（如技术指标、参数、公式、试验方法、检验规则等）的依据，强

8、制性技术内容应说明强制理由本标准确定各项技术内容（如技术指标、参数、公式、试验方法、检验规则等）的依据本实验室积累的人巴贝虫虫种鉴定的实验方法和三方实验室的比对试验结果。六、征求意见与采纳意见情况、不采纳意见的理由（一）采纳意见根据收集的意见，经标准编制专家工作组认真讨论，主要采纳的意见包括，1、封面 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，曹建平研究员提出 “Nucleic acid identification method”，修改为“Identification of species by nucleic acid method”。采纳，5修改为“Identification of sp

9、ecies by nucleic acid method”。2、1 范围 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，汤林华研究员官亚宜研究员提出， “本标准规定了巴贝虫核酸检测的技术规范”应改为“本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测和虫种鉴定”。采纳，改为“本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测和虫种鉴定”3、3 术语和定义 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制，陈军虎研究员提出“Babeisia spp 应为 Babesia spp.；巴贝虫病（Babeisiosis）应为巴贝虫病（Babesiosis）”。 采纳，改为“Babesia spp.和 Bab

10、esiosis”。4、3 术语和定义中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制，官亚宜研究员提出“巴贝虫是一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫，是巴贝虫病（Babeisiosis）的病原体。”改为“巴贝虫是一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫，可引起巴贝虫病。”。采纳，改为“巴贝虫是一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫，可引起巴贝虫病。”5、4 仪器和器材 复旦大学附属华山医院，翁心华教授，中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，官亚宜研究员，华中农业大学，赵俊龙教授，上海市疾病预防控制中心，蔡黎研究员提出“4.1-4.7” 部分参数确定不合理，建议将部分参数的值定的更为宽泛一些；仪器设备名后的解释

11、，建议去掉括号。采纳，4.1-4. 4.7 逐一修改。66、4 仪器和器材中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，许学年研究员，提出“镜头分辨率(H x V)：1,360 x1024，前后二个数字的格式不统一”。采纳。修改为“镜头分辨率(H x V)：1,360 x1，024”。7、5 试剂和材料 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，吕山副研究员，中国农业科学院兰州兽医研究所，关贵全研究员，华中农业大学，贺兰副教授，提出“标题下的两个段落前应空格”；“建议同时设有阳性对照、空白对照、阴性对照”。采纳，阳性对照，空白对照和阴性对照已更改，设置“健康人全血 DNA 为阴性对照”。8、5 试剂和

12、材料 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，官亚宜研究员，提出，5.1 Taq 酶 的“ Taq”应斜体。中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，许学年研究员提出，5.2 “磷酸盐缓冲液（PBS）”建议改为“磷酸盐缓冲盐水（PBS）”或“磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）”。采纳，“Taq 酶”改为“ Taq”酶；“磷酸盐缓冲液（PBS）”改为“磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）”。9、6.1 广东省疾病预防控制中心，邓卓晖主任医师提出，“取 1 mL 临床诊断巴贝虫病例血液样品”建议改为 “取 1 mL 临床诊断或疑似巴贝虫病例血液样品”。采纳，改为“取 1 mL 临床诊断或疑似巴贝虫病例血液样品”。

13、10、6 检测步骤 苏州市疾病预防控制中心，顾灯安副主任医师提出，中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，肖宁研究员，吕山副研究员提出，“6.3.1.2，6.3.2.2，第一轮 pcr 产物 2L 为7模板，而下面列出的各成份表中“DNA 模板”为“3L”，前后不一致。” 采纳。所有 PCR 体系中“DNA 模板”均改成 2L。11、6.3.1.2、6.3.2.2，苏州市疾病预防控制中心，顾灯安副主任医师提出“以“引物”F2 和 R2 进行第二轮.，加上“引物”二字。采纳，加上“引物”二字。12、6 检测步骤 6.3.1.2，苏州市疾病预防控制中心，顾灯安副主任医师，复旦大学，王敬文研究员提出

14、，建议所有 PCR 反应添加最后一步 15C。采纳，均改为“72C，10min; 4C”。13、6 检测步骤 上海市疾病预防控制中心，蔡黎研究员，提出，由于该标准使用均为国内的人员，包括部分基层人员，对英文可能不太熟。而在标准中有不少的单词。建议，用中文。采纳，均改为中文。14、6.3.1.1，6.3.1.2，6.3.2.1，6.3.2.2 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，陈军虎研究员提出，“15mM Mg2+”应为“15mM Mg 2+”。采纳，改为“15mM Mg 2+”。15、7 虫种鉴定 瑞金医院，王剑飚副主任技师，浙江省医学科学院，闻礼永研究员提出，“虫种鉴定，写的太繁琐，应

15、简写；确定相似度 97%、98%、99%数据的依据？”采纳。修改。参考文献见1、11。16、附录 A 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，吕山副研究员，陈军虎研究员，汤林华研究员，提出，表 A.1B.microti 和 B.divergens，种和属之间空格，“Babesia spp”8应为“ Babesia spp.。”，表 A.1 不同巴贝虫株引起症状的比较”应改为“表 A.1 不同巴贝虫种引起症状的比较”。采纳。一一修改。17、附录 A 中国农业科学院兰州兽医研究所，关贵全研究员，提出，“表 A.1 不同巴贝虫虫株引起症状的比较”无章条归属。采纳，在 A.1 中加上“不同巴贝虫虫株引

16、起症状的比较见表A.1。”。18、附录 B，广东省疾病预防控制中心，邓卓晖主任医师提出，B.1.4 能否在标准中推荐使用 GelGreen 等无毒或低毒核酸染料？采纳，删除这一条。19、B.1.1 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，许学年研究员 配方不正确，请参见等渗 PBS 的配置。采纳。修改。20、附 录 C 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，吕山副研究员，提出，表 1，应为“表 C.1”；附表中的引物名称最好能用 18SrRNA 和 ITS 进行区分。采纳。全文均改为“18S-F1，18S-R1，18S-F2，18S-R2，ITS-F3，ITS-R3，ITS-F4，ITS-R

17、4”。21、全文 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，吕山,副研究员提出“，关于数字中添加逗号的问题，如 1,3000 r/min，请全文统一；关于给定一个数值范围中，数字之间的连接符号问题（是“-”，还是“”），请全文统一；关于标点符号问题。请全文统一。”采纳，全文逐一细致修改。9（二）未采纳意见根据收集的意见，经标准编制专家组认真讨论，不予采纳主要意见包括， 1、全文 中国农业科学院兰州兽医研究所，关贵全,研究员，提出，建议全文中“巴贝虫”全改为“巴贝斯虫”。2、标准名和 1 范围 中国农业科学院兰州兽医研究所，关贵全,研究员，提出，由于该标准为诊断人的巴贝斯虫感染，所以建议标准名及范

18、围应限制为人。3、2 规范性引用文件 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 汤林华 研究员 “实验用水应符合 GB/T6682 中一级水的规范”“PCR 实验室应符合 SN/T1193 要求 ”“巴贝虫监测血液样品符合 WSXXX-2015 要求”应删去，在此标准的其他部分提及或在附录中提及。4、4 仪器和器材 4.1 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，曹建平研究员，提出，“超净工作台”，是否应为“生物安全柜”？5、5 试剂和材料 南方医科大学，陈晓光教授，提出，5.3 鉴于疟原虫也寄生于红细胞内，且也经常感染人。不知保守的 18S 和ITS 基因在两者之间的区分度如何？6、6 检测步

19、骤 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，吕山副研究员， 6.3.3.2 应该增加阳性对照的结果描述，以排除反应体系的问题。107、6 检测步骤 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，曹建平研究员，提出，测序分析，建议制定某序列，否则那么多序列到底与哪条比对呢？而且与不同基因比对的结果可能不一样。8、6 检测步骤 中国农业科学院兰州兽医研究所，关贵全研究员，提出，6.3.3.2 PCR 结果判断 结果判定中必须有阳性对照（如加入 4 种巴贝斯虫的阳性基因组 DNA）全出现 XXX 大小的条带，阴性和空白对照未出现条带来判定待检样品的阴阳性的描述；另外使用了 2 种 PCR 方法，如果 18

20、S rRNA 的出现条带，ITS 的没有出现条带，怎样判断？反之亦然。不连接质粒而用“阳性 PCR 扩增产物进行双向测序”，两端的序列能否保证正确性，这样可能会影响序列比对分析中的相似性，从而导致“虫种鉴定”部分较难于操作。9、7 虫种鉴定 复旦大学附属华山医院，翁心华教授， 提出，“GenBank 中巴贝虫 18S rRNA 序列或 ITS 序列”，但附录 C 中未提供。经认真讨论认为，采用比较中性的表述方式较妥，故不予采纳。七、重大意见分歧的处理结果和依据无重大意见分歧。八、根据需要提出实施标准的建议建议本标准由中华人民共和国卫生部批准后作为行业标准推荐执行。九、其他应予说明的事项无。十、参考文献