MTT检测细胞活性的操作方法.DOC

1、MTT检测细胞活性的操作方法一、MTT 是什么MTT 是一种粉末状化学试剂，全称为 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。二、MTT 法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT 主要有两个用途1药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2细胞增殖及细胞活性测定。三、为何 MTT 可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原

2、为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD 值），来判断活细胞数量，OD 值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。四、实验所需材料1MTT 溶液的配制通常 MTT 配成的终浓度为 5mg/ml,须用 PBS 或生理盐水做溶剂。市面上一般 MTT 的包装为 100mg,250mg 或 1g1.1 对于 100mg 这样的小包装，厂家都是将 MTT 放入小管中的，个人建议不

3、要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如 100mg 用 20mlPBS 来溶解。具体做法：预先在 50ml 离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入 20ml PBS，从中先吸取 500-1000ul PBS 装入含 MTT 的小管中，吹打若干次后将其移入 50ml 离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的 MTT 不残留于管内。将 MTT 完全混匀后，用 0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20 度。按细胞培养板每孔需加 10ul 计算，一般每 96 孔板约需 1ml，所以分装时可考虑每管分装 1ml。1.2 对于大包装

4、，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在 EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加。注意事项：1. 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。配成的 MTT 需要无菌，MTT 对菌很敏感MTT 一般最好现用现配，过滤后 4 度避光保存两周内（个人曾做过 4 度避光保存 4 周的 MTT 溶液，效果仍然不错）有效，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当 MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用。MTT 有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2MTT 甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜 DMSO

5、，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。2.2 三联溶解液：SDS10g ，异丁醇 5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成 100ml 溶液，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。该溶解液因含有 SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将 SDS 结晶全部溶解后再使用。五、MTT 法实验步骤1.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至 5-10104/ml。对于初学者而言，要使细胞达到 5-10104/ml 往往不知从何

6、处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。以一般细胞培养常用的 625px2 为例，1)细胞密度在长到约 80%90%（下图所示为 80%90%密度时细胞的大致状态），消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml 培养基使其混匀。2)另取一支新的 15ml 无菌离心管（为下一步接种 96 孔板用），装入约 9ml 培养基.3)从第一步准备的 3ml 细胞悬液中取 1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于 5-10104/ml，该浓度相当于细胞计数板 4 个大格内每大格平均 5-10 个细胞（见下图）；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul 计算。4

7、)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔 2000 个就可以（相当于细胞悬液密度为 2104/ml），细胞毒性实验每孔 500010000 个（相当于细胞悬液密度为 5104/ml）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。2将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入 100ul, 这样待测细胞的密度为 500010000/孔（边缘孔用无菌 PBS 填充）。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加 6 个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于 MTT 的结果至关重要。3.将接种

8、好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般 5-7 个梯度, 每孔 100ul,设 3-5 个复孔.建议设 6 个，否则难以反应真实情况。下图可做为 96 孔板的的参考步局。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到 96 孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在 EP 管中将不同浓度的药物配好，然后将 96 孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入 100ul 含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要

9、把 96 孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于 96 孔板干燥引起细胞死亡。4.5%CO2，37孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。5.每孔加入 10ulMTT 溶液（5mg/ml ，即 0.5%MTT），继续培养 4h。若药物与 MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。6. 终止培养，准备溶解结晶。溶解结晶的方法有两种，第一种，用 DMSO 溶解1) MTT 加入培养 4h 后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把 Formazan

10、结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将 96 孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。2) 每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。另一种方法，用三联溶解液（见上面 MTT 甲瓒溶解液）1) MTT 加入培养 4h 后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入 100ul 溶解液。（该溶解液因含有 SDS，在低温保存的时候易产生

11、结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将 SDS 结晶全部溶解后再使用。）2) 放入培养箱中继续孵育 46 小时，镜下观察，待结晶全部溶解后 570nm 测吸光度。通常 37 孵育 4 小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。在实际的操作过程中，往往为了等待 46 小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测 OD 值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对 OD 值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测 OD 值就可以了。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT、二甲基亚砜）。六、MTT 结果分析关于如何计算 IC50 1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率