质谱分析蛋白的原理与方法浅述.DOC

1、质谱分析蛋白的原理与方法浅述摘要：随着质谱技术的不断发展与成熟，利用质谱法进行蛋白质分析愈来愈广泛和深入。本文简要阐述蛋白质质谱分析的原理和方法。关键字： 蛋白质 质谱分析 原理与方法1概述质谱技术具有较好的灵敏度、准确度，能准确测定蛋白质。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要的地位。 1,2质谱有进样器、离子源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统等组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（E

2、SI-MS）等，各种质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的且准确快速的途径。目前，酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用已成为鉴定蛋白质的发展趋势。2质谱分析蛋白的原理：质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白。通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。2.1 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）简而言之，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱是将多肽成分转换成离子信号，并

3、依据质量/ 电荷之比（M/Z）来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。基质辅助激光解吸附质谱技术（MALDI）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI 所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI 产生的离子常用飞行时间（TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF 检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此 MALDI-TOF 质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。 4

4、,72.2 电喷雾电离质谱（ESI-MS）电喷雾电离质谱（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液-质联用（LC-MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目

5、的。2.3 快原子轰击质谱技术快原子轰击质谱技术（FABMS）是一种软电离技术，是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS 只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMSMS 串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息。3质谱分析蛋白的方法：用于质谱分析蛋白质的方法主要有三种：肽质量指纹图谱法（PMF）、串联质谱法（CID）和梯形肽片段测序法（ladderpeptide sequencing）。3.1肽质量指纹图谱（PMF）肽质量指纹图谱（

6、PMF）即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的相对分子质量，将所得的蛋白酶解肽段质量数在相应的数据库中检索，寻找相似肽指纹谱，从而绘制“肽图”。由此可见，分子质量的精确度是PMF的关键指标所在，但蛋白质的翻译后修饰可能使PMF的质量数与理论值不符，故这就需要与序列信息适当结合。3.2串联质谱法（CID）串联质谱法（CID）是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳定离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。串联质谱的肽序列图需要读出部分氨基酸序列与前后的离子质量和肽段母质量相结合，这种鉴定方法称为肽序列标签（PST）。3.3梯形肽片段测

7、序法（ladder peptide sequencing）梯形肽片段测序法（ladder peptide sequencing），与Edman法有相似之处，是用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，产生包含仅异于1个氨基酸残基质量的系列肽，名为ladder，经质谱检测，由相邻肽峰的质量差而得知相应氨基酸残基。其中的问题是由于酶解速度不一，易受干扰。4.蛋白质质谱分析中的问题4.1 蛋白质消化蛋白消化蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6- 20 个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用

8、的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。4.2 蛋白质修饰问题在目前条件下，质谱很难 100%给出肽段的序列，经常会丢失一些肽段，蛋白质磷酸化修饰也会抑制胰蛋白酶的酶解，并且磷酸化肽的含量较非磷酸化肽段的含量少很多，质谱对磷酸化肽的响应就可能会被抑制。因此，要尽可能把非磷酸化肽段的含量降到最小。减少非磷酸化肽的方法有分馏、IMAC（固相化金属亲和色谱）和抗体结合。通过 MALDI-TOF-MS 测定肽段的分子量，根据所得肽段分子量比预计的分子量大 80Da或其整倍数，判定是否存在

9、磷酸化修饰。4.3 精确度问题在质谱序列测定中，质谱的准确性对测定结果有很大影响，这是由于质谱测序的关键在于测定相邻肽链之间的分子量差别以判断相应的氨基酸残基。如果测量的绝对质量误差在 0.5 以上，则不能够有效区分质量数差在 1 以内的氨基酸残基。参考文献：1王岚等.生物质谱技术在蛋白质组学研究中的应用.生物技术通讯 J.Vol.18.2007.No.1:166；2陈晶等.质谱在肽和蛋白质序列分析中的应用.有机化学.2002 第 22 卷.第二期.81-90;3郑永红等.生物质谱技术在蛋白质结构鉴定中的应用进展.解放军药学学报 .第 20 卷第 1 期.62;4刘骁勇等.蛋白质组学研究中的质

10、谱技术.山东省医药生物技术研究中心；5刘康等.蛋白质组学研究中的质谱鉴定与生物信息学分析.棉花学报 .2008.20：281-288;6成海平等.蛋白质组研究的技术体系及进展.生物化学与生物物理进展 .2000.27(6).588;7吕茂民等.生物质谱技术及其应用.生物技术通报.2001 年第 4 期；8蔡耘等.生物质谱技术在糖蛋白结构分析中的应用.2002.Sep.Vol.13.No.5.404;9孟凡臣等.生物质谱及其在蛋白质组学研究中的应用.生物技术通报 .2006，May.Vol.17.468-470 ；10韩伟东等.牛精子蛋白质的双向电泳和质谱鉴定初步研究.安徽农业大学学报 .2009，36（4）：538-542。