桃仁多肽的酶法制备及其抗氧化活性分析.DOC

1、桃仁多肽的酶法制备及其抗氧化活性分析杨玉蓉 1 李安平 1,* 钟政昌 2 李刚 1（中南林业科技大学食品科学与工程学院 1，长沙 410004）（西藏农牧学院食品科学学院 2，林芝 860000） ）摘 要：以桃仁蛋白为原料，对响应面法优化多肽制备条件和酶解多肽各组分的抗氧化活性进行了研究。结果表明：以底物浓度 3.5 %、pH 10.4、加酶量 4 200 U/g、酶解时间 4.9 h 条件下进行碱性蛋白酶酶解，可获得桃仁蛋白的最高水解度（61.120.7）% 和多肽得率（67.910.5）%。桃仁蛋白及其酶解物的 SDS-PAGE 凝胶电泳图表明，酶解后的多肽分子质量大部分小于 12 0

2、00 u。酶解液（PPH ）及其超滤分离所得4 组分分别采用 DPPH 自由基清除能力、 ABTS 自由基清除能力、亚硝酸根离子清除能力和总抗氧化能力等 4 个体外抗氧化活性测试，结果显示不同分子质量组分间的抗氧化活性存在显著性差异（P0.05） ，分子质量越小，其抗氧活性越强。RP-HPLC 分析表明，抗氧化活性最强的 P-IV 组主要由 9 种具有一定疏水性的多肽组成。关键词：桃仁多肽 酶解 抗氧化活性 SDS-PAGE 反相高效液相色谱中图分类号：TS209 文献标志码：A 文章编号：Preparation of Peptides from Peach Kernel Protein by

3、 Enzymolysis and Its Antioxidant Capacity in vitroYang Yurong1 LI Anping1* Zhong Zhengchang2 Li Gang1(College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology1. Changsha 410004)( College of Food Science, Xizang Agriculture and Animal Husbandry College2. Linzhi 860

4、000)Abstract: The study aims to optimize the enzymatic hydrolysis condition and detect in vitro antioxidant capacities of hydrolytic Peach kernel peptides. The degree of hydrolysis (DH) and extraction rate of peptide, as responses, were optimized by using Response Surface Methodology (RSM). The opti

5、mization results were substrate concentration of 3.5%, pH value 10.4, enzyme dosage 4 200 U/g and hydrolysis time of 4.9 h. Under this optimum condition, the DH and extraction rate of peptide were (61.120.7) % and (67.910.5) %, respectively. The SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight of

6、peach kernel hydrolytic peptides was under 12 000 u. 4 components with different molecular weight were separated from peach kernel protein hydrolysate (PPH) by ultra-filtration. The scavenging capacities of DPPH radical, ABTS radical and nitrite as well as total antioxidant capacity test were adopte

7、d to evaluate the antioxidant capacity of 4 components and PPH. Results suggested that there was a significant difference in antioxidant capacity between different molecular weight components (P0.05). The smaller the molecular weight, the stronger the antioxidant activity is. Finally, the highest an

8、tioxidant capacity peptide P-IV (3 000 u) was analyzed by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC). The Reversed Phase High Performance Liquid Chromatogram of P-IV indicated that P-IV has about 9 components with a certain level of hydrophobicity. 1Key words: Peach kernel hydro

9、lytic peptide, Enzymatic hydrolysis, Antioxidant capacity, SDS-PAGE, RP-HPLC基金项目：西藏农业重大专项（Z2016B01N04）收稿日期：2017-08-06作者简介：杨玉蓉，女，1993 年出生，硕士，森林食物资源的深度加工与利用通讯作者：李安平，男，1967 年出生，教授，森林食物资源的深度加工与利用桃仁为蔷薇科植物桃 Prunus persica (L.) Batsch 或山桃 P. davidiana (Carr.) Franch.的干燥成熟种子，具有活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘的功效 1。桃仁主要含有油脂及蛋

10、白质，其中蛋白质质量分数在 25%30%之间 2。桃仁蛋白中清蛋白质量分数高达 86.83%，且具有良好的溶解性、泡沫稳定性、乳化稳定性以及较低的凝胶浓度 3。我国桃仁资源非常丰富，但目前桃仁除部分用于中医药外，绝大部分被丢弃，造成资源浪费。国内外对桃仁的研究主要集中在它的化学成分、化学性质、药理作用、蛋白免疫学方面。刘云 2研究了桃仁蛋白的提取、蛋白性能和氨基酸组成。王桂华等 4研究发现桃仁提取物对急性胰腺炎大鼠肠道屏障功能具有保护作用，并且能减轻炎症反应。Kim G J 等 5发现桃仁的甲醇提取物能抑制组胺释放，以及抑制肿瘤坏死因子（TNF-）和白细胞介素（IL-6）的基因表达，具有一定的

11、抗炎抗过敏作用。但桃仁活性多肽的研究尚未见诸报道。利用酶水解蛋白质可获得具有良好抗氧化活性的多肽 6-8，是当前研究热点之一。 张一帆等 9采用胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶解杨梅蛋白，获得了具有最强抗氧化能力和 -葡糖糖苷酶抑制活性的杨梅多肽。范金波等 10采用碱性蛋白酶水解家蚕丝胶制备出具有较强抗氧化活性的丝胶多肽。Abdel-Hamid M 等 11发现 水解牛奶抗氧化肽具有抑制细胞膜脂质过氧化的作用。本研究通过筛选适宜的蛋白酶探索最优的桃仁蛋白酶解条件，并对超滤分离酶解液所得各组分进行体外抗氧化活性测定和成分分析，为桃仁的进一步开发利用提供依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂桃仁：产自西藏林

12、芝地区；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶：上海瑞永生物科技有限公司；1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼（DPPH ）自由基、ABTS 自由基：美国 Sigma-Aldrich 集团公司；总抗氧化能力检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；谷胱甘肽（GSH）：美国 Genview 公司；蛋白质电泳 Marker：美国 Thermo Scientific 公司；其他试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备高速冷冻离心机：美国 Thermo Fisher Scientific 公司；真空冷冻干燥机：美国 GOLD-SIM 公司；电泳仪、小垂直板电泳槽：美国 BIO-RAD 生化科技有限公司；ChemiDoc

13、 XRS+电泳自动成像仪：美国 BIO-RAD 生化科技有限公司；WondaSil C18-WR（5 m，4.6250 mm）：Shimadzu-GL 公司；LC-20AT 高效液相色谱仪：日本 Shimadzu 公司。1.3 桃仁多肽最佳提取工艺研究1.3.1 桃仁蛋白的提取参考赵敏 12等的方法提取桃仁蛋白，稍作修改。工艺流程为：桃仁粉碎石油醚脱脂加水分散调 pH 值至碱性搅拌 1 h离心（8 000 r/min、25 min）取上清液调 pH 值至酸性离心（8 000 r/min 、25 min ）取沉淀冷冻干燥桃仁蛋白。1.3.2 蛋白酶的筛选选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶等

14、3 种酶对桃仁蛋白进行酶解，酶解时的固定加酶量为 3 000 U/g，底物浓度为 2%，在各种酶的最适温度和 pH 值环境中酶解 3 h，比较 3 种酶酶解桃仁蛋白的水解度和多肽得率。1.3.3 桃仁蛋白水解度和多肽得率的计算蛋白质含量测定按 GB 5009.52010 方法进行；多肽含量测定按照汪志华等 14的方法进行。取一定质量桃仁蛋白（N）酶解，离心得上清液，然后将上清液与三氯乙酸（TCA）按 13 的体积比加入 0.4 mol/L TCA，混合均匀，静置 15 min 后，10 000 r/min 离心 15 min，根据双缩脲法在 540 nm 处测定离心上清液的吸光度 A，将其带入

15、谷胱甘肽标准曲线（y=0.007 38x+0.114 76，r 2=0.993 6）计算酶解液中多肽含量（ M） 。多肽得率按下式计算：多 肽 得率 /%= 上清液多 肽 含量（ M）底物蛋白粉中蛋白 质 含量（ N）100 蛋白质水解度测定按照杨文博 13的方法进行，取一定质量桃仁蛋白（N）酶解，离心后上清液按体积比13加入质量分数为10%的三氯乙酸，混合均匀，静置15 min后，10 000 r/min离心15 min，沉淀为未水解的蛋白质，上清液为肽类和氨基酸，采用凯氏定氮法测定上清液酸溶蛋白含量（L） ，按下式计算蛋白水解度：水解度 （ DH） %=水解后酸溶蛋白 （L）总 蛋白 （N

16、） 1001.3.4 桃仁多肽制备条件的响应面试验单因素试验分别比较了底物浓度（取 1%、2%、3%、4%、5%） 、pH 值（pH 为7、8、9、10、11） 、酶解时间（取 1、2、3、4、5 h）和加酶量（取 3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g）对桃仁蛋白水解度和多肽得率的影响，根据单因素试验结果，利用 Design-expert 软件，采用 Box-Behnken 中心组合试验设计。以水解度和多肽得率为评价指标，优化桃仁蛋白多肽制备条件，试验因素水平编码见表 1。表 1 响 应 面 试 验 设 计 因 素 水 平水平因素-1 0 1A 底物浓度/% 3

17、4 5B pH 9 10 11C 加酶量/（U/g) 3 000 4 000 5 000D 酶解时间/h 3 4 51.4 桃仁多肽体外抗氧化活性的研究1.4 .1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将桃仁蛋白酶解后的上清液冻干，然后配制成 10 mg/mL 的酶解溶液，与 10 mg/mL 的桃仁蛋白溶液于 95 保温 5 min，10 000 r/min 离心 2 min 后，再与标准蛋白 Marker 溶液分别上样 5 L，分离胶和浓缩胶质量浓度分别为 15%和 4%。电泳结束后，用考马斯亮蓝 R-250 对凝胶片进行染色，脱色后的凝胶片用电泳自动成像仪拍照。1.4.

18、2 不同分子质量桃仁多肽的分离酶解制备的桃仁多肽溶液用不同孔径的超滤膜（10 000、5 000、3 000 u）进行超滤，再经过纳滤膜脱盐，最后分别收集各分子质量的多肽溶液，经过冷冻干燥后，得到 4 种不同分子质量的桃仁多肽：P-I（10 000 u） 、P-II（5 00010 000 u） 、P-III（3 000 5 000 u） 、P-IV（ 3 000 u） ，冷藏备用。1.4.3 DPPH 自由基清除率测定方法参考张玲等 15的方法对桃仁多肽进行 DPPH 自由基清除能力的测定。配制 0.1 mmol/L 的 DPPH无水乙醇溶液，避光保存。在试管中加入 1 mL 待测液和 1

19、mL 的 DPPH 溶液，振荡后避光静置 30 min，于 517 nm 处测定吸光值 A。另取 2 支试管，分别加入 1 mL 待测液和 1 mL 无水乙醇作样品对照测定吸光值 B，1 mL 水和 1 mL 的 DPPH 溶液作空白组测定吸光值 C。以 GSH 为阳性对照。按下式计算 DPPH 自由基的清除率。DPPH自由基清除率 （ %） =C-(A-B)C 100 式中：A 为样液与 DPPH 试剂混合液的吸光值；B 为样液与空白溶剂混合液的吸光值； C 为DPPH试剂与空白溶剂混合液的吸光值。1.4.4 ABTS 自由基清除率测定方法 16用去离子水配置 7 mmol/L 的 ABTS

20、 储备液和 2.45 mmol/L 的过硫酸钾溶液，将两种溶液等比例混合，避光室温条件下静置 1216 h，得到 ABTS 工作液，临用前用去离子水稀释 ABTS 工作液使其在 734 nm 处的吸光值为 0.700.72。取 1.0 mL 稀释后的 ABTS 工作液与 1mL 样品溶液混合，室温避光 10 min，在 734 nm 处测定吸光度。以 GSH 用作阳性对照。按下式计算 ABTS 自由基的清除率。ABTS自由基清除率 （ %） =Ac-AsAc 100 式中：A c 为 ABTS 试剂与空白溶剂混合液的吸光值；A s 为 ABTS 试剂与样液混合液的吸光值。1.4.5 亚硝酸盐清

21、除能力测定方法参照 GB500933-2010 中规定的测定亚硝酸盐的方法加以改进。在具塞比色管中，加入 1 mL 5 g/mL NaNO2 和 2 mL 样液，反应 10 min；再加入 2 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，反应 5 min；最后加入 1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，用去离子水定容至 25 mL，反应 15 min 后，在 538 nm 处测定吸光度。以 GSH 为阳性对照。按下式计算亚硝酸根离子清除率。亚 硝酸根离子清除率 /%=Ac-ASAc 100 式中：A c 为未加入样液时测定的吸光值；A s 为加入样液时测定的吸光值。1.4.6 总抗氧化能力测定采用总抗氧化能

22、力（T-AOC）试剂盒进行测定，以 GSH 为阳性对照。1.4.7 反向高效液相色谱（RP-HPLC）分析取 P-IV 组分溶液冷冻干燥，再将其配成一定浓度的样品溶液，然后用 0.45 m的滤膜过滤备用。色谱条件：色谱柱为 WondaSil C18-WR（5 m，4.6250 mm ） ，流动相（A：去离子水+0.1%甲酸；B：乙腈 +0.1%甲酸） ，上样量 5 L，洗脱流速 1 mL/min，检测波长 220 nm，柱温 40 。洗脱条件：010 min 90%流动相 B，1035 min 9055%流动相 B，35 50 min 55-0%流动相 B，5051 min 090%流动相 B

23、，51 min 后结束。1.5 数据处理每组试验均重复 3 次，数据结果表示为平均值标准偏差。利用 SPSS17.0 统计软件进行 One-way ANOVA 分析，显著性水平为 P0.05。2 结果与讨论2.1 蛋白酶的筛选注：不同大写字母表示桃仁蛋白的水解度具有显著性差异，不同小写字母表示桃仁蛋白的多肽得率具有显著性差异（P0.05） 。图 1 不 同 蛋 白 酶 酶 解 桃 仁 蛋 白 结 果由图 1 看出，桃仁蛋白在 3 种蛋白酶各自的最适宜条件下进行酶解，不同酶处理间的水解度和多肽得率存在显著性差异（P0.05） 。风味蛋白酶和碱性蛋白酶的水解度高达 70%以上，显著高于中性蛋白酶（

24、P0.05 ） ；碱性蛋白酶的多肽得率为 68.42%，与得率为 54.58%的风味蛋白酶存在显著性差异（P 0.05） ，而风味蛋白酶又显著高于中性蛋白酶。综合考虑 3 种酶的多肽得率和水解度，试验选用碱性蛋白酶制备桃仁多肽。2.2 桃仁多肽制备的响应面优化2.2.1 响应面试验设计及结果表 2 桃 仁 多 肽 制 备 的 响 应 面 试 验 设 计 与 结 果试验号 X1 底物浓度/% X2 pH 值 X3 加酶量/(U/g) X4 酶解时间/h Y1 水解度 /% Y2 多肽得率/%1 4 11 5 000 4 53.44 63.682 4 11 4 000 3 49.97 71.163

25、 5 11 4 000 4 49.54 70.344 4 10 4 000 4 56.83 74.825 3 10 3 000 4 58.86 44.056 4 10 4 000 4 58.70 75.307 5 10 5 000 4 56.32 61.068 4 10 4 000 4 57.00 74.739 4 10 3 000 3 50.72 51.2110 4 11 3 000 4 55.80 59.2211 5 10 4 000 3 53.07 65.0512 4 10 4 000 4 56.50 76.8313 3 10 4 000 3 55.19 43.9414 4 10 3 0

26、00 5 56.48 46.4615 5 9 4 000 4 54.70 59.2216 4 10 5 000 3 56.49 49.0717 4 9 4 000 3 53.61 51.0818 4 9 5 000 4 57.85 47.3619 4 9 3 000 4 56.32 49.3820 4 10 4 000 4 57.34 77.3921 4 10 5 000 5 60.87 66.7722 3 9 4 000 4 57.23 42.0023 3 11 4 000 4 59.26 67.2624 5 10 3 000 4 53.40 48.8925 3 10 5 000 4 62.

27、88 38.1826 5 10 4 000 5 55.37 60.0127 4 9 4 000 5 60.90 59.3928 3 10 4 000 5 68.31 51.1629 4 11 4 000 5 57.85 70.21以单因素试验结果为基础，根据 Box-Behnken 设计原理，以底物浓度、 pH、加酶量、酶解时间为自变量，水解度和多肽得率为响应值进行响应面试验，试验结果见表 2。2.2.2 模型建立及显著性分析以水解度和多肽得率为响应值，通过 Design-Expert 软件对表 2 数据结果进行分析，拟合出响应面回归模型分别为：Y 1=57.28-3.28 X1-1.23X2

28、+1.36X3+3.39 X4-1.80 X1X2-0.28X1X3-2.70 X1X4-0.97X2X3+0.15X2X4-0.35X3X4+0.44 X12-1.76X22-0.14X32-0.22X42；Y 2=75.81+6.50X1+7.79X2+2.24X3+1.87X4-3.54X1X2+4.51X1X3-3.07X1X4+1.62X2X3-2.31X2X4+5.61X3X4-12.18 X12-4.79X22-15.41X32-7.89X42；回归模型方差分析结果分别见表 3 和表 4。由表 3 和表 4 可知，两回归模型均达到极显著（P0.01） ，模型失拟项均不显著（P 0

29、.05） ，决定系数 R2 分别为 0.9182 和 0.9772，变异系数分别为 2.74 和 4.29，模型预测值与实际误差值较小，均可用此模型预测真实值。表 3 水 解 度 回 归 模 型 方 差 分 析 表方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 PF 显著性模型 378.58 14.00 27.04 11.22 F 显著性模型 3 867.36 14.00 276.24 42.94 0.0001 *残差 90.06 14.00 6.43失拟项 84.12 10.00 8.41 5.66 0.054 6纯误差 5.94 4.00 1.49总方差 3 957.42 28.00R2 0.97

30、7 2R2adj 0.954 5注：*. 差异极显著（P0.01） ；*. 差异显著（P0.05） 。2.2.3 多肽制备的响应面分析根据回归模型相应的 3D 曲面图可知，当响应值水解度为极大值时，各因素最适值分别为：底物浓度 3.00%、pH 9.93、加酶量 5 000 U/g、时间 5.00 h；当响应值多肽得率为极大值时，各因素最适值分别为：底物浓度 4.18%、pH 10.77、加酶量 4 143.14 U/g、酶解时间 4.02 h。综合考虑水解度和多肽得率尽可能同时达到最大值，获得水解度为 62.91%、多肽得率为 68.97%的各因素最适宜条件为：底物浓度 3.49%、pH 1

31、0.39、加酶量 4 233.87 U/g、酶解时间 4.88 h；考虑到试验的可行性，最终将最优工艺参数调整为：底物浓度 3.5%、pH 10.4、加酶量 4 200 U/g、酶解时间 4.9 h。2.2.4 最佳酶解条件的验证根据上述优化调整后的最适宜酶解条件进行验证试验，获得的桃仁蛋白酶解的水解度为（61.120.7）% 、多肽得率为（ 67.910.5）%。比较实际值与预测值，其差异小于 5%，说明预测条件与实际情况符合，可较好的反映桃仁酶解的工艺条件，具有合理性和适用性。2.3 桃仁多肽体外抗氧化能力的测定2.3.1 桃仁蛋白与酶解液凝胶电泳分析桃仁蛋白、酶解物和标准蛋白 Marke

32、r 的 SDS-PAGE 凝胶电泳图如图 4。将图 4 中 A 泳道的标准蛋白条带的相对迁移率对分子质量的对数作图，得标准曲线：y = -1.596 4x+2.205 4（r= 0.957 4） 。从图 4 中的 B 泳道可知，桃仁蛋白共有 7 个条带，将各条带的相对迁移率带入 Marker 标准曲线中，得桃仁蛋白各条带分子质量分别为：B1（86 020 u） 、B2（ 47 650 u） 、B3（36 640 u） 、B4（28 018 u） 、B5 （19 640 u） 、B6（17 220 u） 、B7（12 010 u） 。桃仁蛋白组分中 B2、B3、B5、B6 四条条带的颜色较深。染

33、色后的条带颜色越深，说明该蛋白的含量越高，颜色浅则说明含量相对较低 17。因此，桃仁蛋白中主要是由 B2、B3、B5、B6 四种蛋白质构成。从图 4 中的 C 泳道可知，桃仁蛋白酶解物共分离出 5 个条带，将各条带的相对迁移率带入Marker 标准曲线中，得酶解液中各条带的分子质量为：C1（23 920 u） 、C2（20 300 u） 、C3（11 620 u） 、C4（ 9 230 u） 、C5（6 650 u） 。从条带深浅可看出桃仁蛋白酶解物以 C3、C4、C5 三个组分为主，碱性蛋白酶酶解后的分子质量主要分布在 12 000 u 以下。经碱性蛋白酶酶解后，桃仁蛋白酶解液的分子量相对于

34、桃仁蛋白显著减小，碱性蛋白酶对桃仁蛋白具有较好的酶解效果。A.标准蛋白 Marker；B.桃仁蛋白；C.桃仁蛋白酶解液图 4 桃 仁 蛋 白 、 桃 仁 蛋 白 酶 解 液 的 SDS-PAGE 图2.3.2 桃仁多肽体外抗氧化能力测定注：不同小写字母 a1、b 1、c 1 表示不同分子质量组分的 DPPH 自由基清除能力具有显著性差异， （P0.05） ；不同小写字母a2、b 2、c 2、d 2 表示不同分子质量组分的 ABTS 自由基清除能力具有显著性差异， （P0.05） ；不同小写字母 a3、b 3、c 3、d 3、e 3表示不同分子质量组分的亚硝酸根离子清除能力具有显著性差异， （P

35、0.05） ；不同小写字母 a4、b 4、c 4 表示不同分子质量组分的总抗氧化能力具有显著性差异；（P0.05） 。图 5 各 组 分 抗 氧 化 能 力 测 定基于碱性蛋白酶酶解后的多肽分子质量主要分布在 12 000 u 以下，因此选用截留分子质量为 10 000、5 000、3 000 u 的超滤膜进行超滤。酶解液经超滤分离后得到四组不同分子质量的组分：P-I（ 10 000 u） 、P-II （5 00010 000 u） 、P-III （3 0005 000 u） 、P-IV（3 000 u)。四组不同分子质量组分和酶解物（PPH）分别采用 DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由

36、基清除能力、亚硝酸根离子清除能力和总抗氧化能力测试其抗氧化活性能力，结果如图 5。从图 5 可知，酶解物（PPH 组）与大分子质量组（P-I 组）经 4 种抗氧化活性方法测试均表明它们之间没有显著性差异（P0.05） 。从 P-I、P-II、P-III 到 P-IV 组的分子质量依次递减，而 4 种抗氧化活性测试均表明其抗氧化活性依次增强，到 P-IV 组时达到最大值（DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、亚硝酸根离子清除能力和总抗氧化能力分别达到 11.490.13、1 323.927.69、32.640.56 和 239.2510.63（mg GSH/g） 。研究表明 18，

37、蛋白酶解物的抗氧化能力与其分子质量大小有关，低分子质量的肽和水解产物显示出更强的抗氧化活性。Wang X 19在研究米糠蛋白酶解物和超滤各组分的抗氧化活性时发现，分子质量越小其抗氧化活性越强。毛晶等 20研究也发现，酶解松仁蛋白并超滤后分子质量小于 3 000 u 的组分具有更强的自由基清除能力。低分子质量多肽对自由基具有更强的清除能力，其原因可能是这些低分子质量的多肽分子量小、体积小，更容易接近自由基并且能更容易给自由基提供质子或电子 21。2.4 P-IV 组分的反相高效液相色谱分析图 6 P-IV 组 分 的 反 相 高 效 液 相 色 谱 图超滤分离的 5 组组分中以 P-IV 组的抗

38、氧化活性最强，因此采用反相高效液相色谱法进一步对其组分分析，结果见图 6。由图可看出，P-IV 组主要由 9 种多肽组成。在 3 min 左右出现一倒峰，初步判断此峰为溶剂峰。由于样品溶剂与流动相不同，溶剂会有一定的紫外吸收，从而形成溶剂峰 22。除 5 min、7.5 min 和 12.5 min 处有峰外，出峰时间集中在 2030 min 区间，而此时有机相浓度较大，根据相似相容原理，因此此区间段多肽具有一定的疏水性。研究表明 23，多肽抗氧化活性与多肽的疏水性呈正相关。Silva F G 24在研究亚麻籽蛋白多肽的抗氧化活性时，发现抗氧化多肽含有 34.7%的疏水性氨基酸。孙英 25采用

39、反相液相色谱分析茶籽多肽抗氧化性时也证实，保留时间较长的组分主要是富含疏水性氨基酸的抗氧化肽。此结论从一个侧边解释了 P-IV 组抗氧化活性较高的原因。3 结论3.1 在单因素试验的基础上运用响应面法优化桃仁多肽制备条件为：底物浓度 3.5%、pH 10.4、加酶量 4 200 U/g、酶解时间 4.9 h。在此工艺条件下，可获得 61.12%的桃仁蛋白水解度和 67.91%的多肽得率；3.2 SDS-PAGE 凝胶电泳得到的酶解物多肽分子质量主要分布在 12 000 u 以下，与桃仁蛋白分子质量相比有显著降低；DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、亚硝酸根离子清除能力和总抗氧化

40、能力测试表明，超滤分离的 P-I、P-II、P-III、P-IV 四组不同分子量的酶解多肽中，小分子质量多肽具有更强的抗氧化活性；P-IV 组的反相高效液相色谱分析表明，P-IV 组分主要由 9 种多肽组成，且具有一定的疏水性。参考文献：1 王仁芳, 范令刚, 高文远,等. 桃仁化学成分与药理活性研究进展J. 现代药物与临床, 2010, 25(6):426-429.Wang R F, Fan L G, Gao W Y, et al. Advances in research of chemical constituents and pharmacological activities of

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