蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、.DOC

1、1蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测（KJ201710）1 范围本方法规定了蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测方法。本方法适用于油菜、菠菜、芹菜、韭菜等蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速测定。酶抑制（率）法（分光光度法）2 原理在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm 处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率。3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分

2、析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 丙酮（CH 3COCH3）。3.1.2 磷酸氢二钾（K 2HPO4）。3.1.3 磷酸二氢钾（KH 2PO4）。3.1.4 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（C 14H8N2O8S2）。3.1.5 碳酸氢钠（NaHCO 3）。3.1.6 碘化乙酰硫代胆碱（ C 7H16INOS）。3.1.7 pH8.0 缓冲溶液：分别称取 11.9 g 无水磷酸氢二钾及 3.2 g 磷酸二氢钾，溶解于 1000 mL水中，混匀。3.1.8 显色剂：分别取 160 mg 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和 15.6 mg 碳酸氢钠

3、，用 20 mL 缓冲溶液溶解，4 冰箱中保存。3.1.9 底物：取 125 mg 碘化乙酰硫代胆碱，加 15 mL 蒸馏水溶解，摇匀后置于 4 冰箱中保存备用。保存期不超过两周。3.1.10 乙酰胆碱酯酶：4 冰箱中保存备用。23.2 参考物质3种有机磷和2种氨基甲酸酯类农药参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均98%。表 1 有机磷和氨基甲酸酯类参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量序号 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子质量1 克百威 Carbofuran 1563-66-2 C12H15NO3 221.25

4、2 灭多威 Methomyl 59669-26-0 C5H10N2O2S 162.233 丙溴磷 profenofos 41198-08-7 C11H15BrClO3PS 373.634 敌敌畏 Dichlorvos 62-73-7 C4H7Cl2O4P 220.985 敌百虫 Dipterex 52-68-6 C4H8Cl3O4P 257.443.3 标准溶液的配制3.3.1 克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准储备液（1000 g/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存。3.3.2 丙溴磷标准储备液（100 g/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存。3.3.3 克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准中

5、间液 A（100 g/mL）：精密移取上述标准储备液（1000 g/mL）（3.3.1）各 1mL，分别置于 10mL 容量瓶中，用丙酮（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 100 g/mL的标准液 A。3.3.4 克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫、丙溴磷标准中间液 B（1 g/mL）：精密移取标准中间液 A（100 g/mL）（3.3.3）及丙溴磷标准储备液（100 g/mL）（3.3.2）各 1 mL，分别置于100 mL 容量瓶中，用缓冲溶液（3.1.7）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为 1 g/mL 的标准中间液B。4 仪器和设备4.1 恒温水浴锅。4.2 天平：感量为 0.1 g。4

6、.3 分光光度计或相应商品化测定仪。4.4 环境条件：温度 15 35 ，湿度80%。5 分析步骤5.1 试样的提取5.1.1 整株提取法选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3 g（精确至0.1 g）置于表面皿3中，加入10 mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50 次，静置2 min以上，取上清液备用。5.1.2 整体测定法选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取3 g（精确至0.1 g）放入离心管中，加入10 mL缓冲溶液（3.1.7），振摇50 次，静置2 min以上，倒出提取液，静置3 min5 min，待用。5.2

7、 测定步骤5.2.1 对照液的测定先于反应管中加入3 mL缓冲溶液（3.1.7），再加入适量酶液、0.1 mL显色剂，摇匀后于37 水浴锅中放置15 min。加入 0.1 mL底物摇匀，立即测定吸光度，3min后再测定一次，记录反应3min的吸光度值的变化A 0。5.2.2 样品液的测定先于反应管中加入3 mL提取液，其他操作与对照液操作（5.2.1）相同，记录反应3 min的吸光度值的变化A t。5.3 质控试验每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。5.3.1 空白试验称取空白试样，按照5.1和5.2步骤与样品同法操作。5.3.2 加标质控试验5.3.2.1 韭菜、芹菜加标实验取空白试样

8、，擦去表面泥土，称取5份试样各3 g（精确至0.1 g）置于表面皿中，分别加入检出限水平的有 机 磷 和 氨 基 甲 酸 酯 类 标准中间液B（ 1 g/mL） （3.3.4），加入10 mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50 次，静置2 min 以上，取上清液备用。其余操作按照5.2步骤同法操作。5.3.2.2 油菜、菠菜加标实验取空白试样，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取 5 份试样各3 g（精确至0.1 g）放入小离心管中，分别加入检出限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（ 1 g/mL）（3.3.4），加入10 mL缓冲溶液（3.1.7），振摇5

9、0 次，静置2 min以上，倒出提取液，静置3 min5 min，待用。其余操作按照5.2步骤同法操作。6 结果的表述6.1 结果计算抑制率（% ） =（A 0-At）/A 0100式中：A0 对照溶液反应 3 min吸光度的变化值；At 样品溶液反应3 min吸光度的变化值；46.2 结果判定结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。当抑制率50%时，表示蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留高于检测限，判定为阳性，阳性结果的样品需要重复检验2 次以上。6.3 质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。7 结论当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品

10、种和含量。8 性能指标8.1 检测限：敌百虫 0.1 mg/kg，丙溴磷 0.5 mg/kg，灭多威 0.2 mg/kg，克百威 0.02 mg/kg，敌敌畏 0.2 mg/kg。8.2 灵敏度：灵敏度应95%8.3 特异性：特异性应85%。8.4 假阴性率：假阴性率应5%。8.5 假阳性率：假阳性率应15%。注：1.性能指标计算方法见附录 A。2.吸光度变化A 0值应控制在0.20.3之间。具体的酶量，应根据产品说明书上标识的使用量，测定 A0值。根据测定值，增加或减少酶量，使A 0值控制在0.20.3之间。检测卡法9 原理样品中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留经缓冲液提取，有机磷和氨基甲酸酯

11、类农药对胆碱酯酶（白色药片）有抑制作用，抑制胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸与靛酚（蓝色），从而导致速测卡颜色深浅的变化。通过空白颜色比较，对样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药进行定性判定。10 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。10.1 试剂10.1.1 丙酮（CH 3COCH3）。10.1.2 磷酸氢二钾（K 2HPO4）。10.1.3 磷酸二氢钾（KH 2PO4）。510.1.4 pH8.0 缓冲溶液：分别称取 11.9 g 无水磷酸氢二钾及 3.2 g 磷酸二氢钾，溶解于 1000 mL水中，混匀。10.2 参考物质同3.2。

12、10.3 标准溶液的配制同3.3。10.4 固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（检测卡）。11 仪器和设备11.1 恒温水浴锅。11.2 天平：感量为 0.1 g。11.3 环境条件：温度 15 35 ，湿度80%。12 分析步骤12.1 试样的提取12.1.1 整株提取法选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3 g（精确至0.1 g）置于表面皿中，加入10 mL 缓冲液（10.1.4 ），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50 次，静置2 min以上。12.1.2 整体测定法选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取3 g（精确至0.1 g）放入小

13、离心管中，加入10 mL缓冲溶液（10.1.4），振摇50 次，静置2 min 以上。12.2 测定步骤吸取2 滴左右待测液于白色药片反应区域，在37 恒温装置中放置15 min进行预反应，预反应后的药片表面必须保持湿润。将速测卡对折，手捏3 min或置于37 恒温装置3 min，保证红色药片反应区域与白色药片反应区域完全叠合发生反应。每次测定需有一个缓冲溶液的空白对照。12.3 质控试验每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。12.3.1 空白试验称取空白试样，按照 12.1 和 12.2 步骤与样品同法操作。12.3.2 加标质控试验612.3.2.1 韭菜、芹菜取空白试样，擦去表面泥土

14、，称取5份试样各3 g （精确至0.1g）置于表面皿中，分别加入检出限水平的有 机 磷 和 氨 基 甲 酸 酯 类 标准中间液 B（ 1 g/mL） （3.3.4），按照12.1和12.2步骤与样品同法操作。12.3.2.2 油菜、菠菜选取空白试样，擦去表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，称取5份试样各3 g（精确至0.1 g）放入小离心管中，分别加入检出限水平的有 机 磷 和 氨 基 甲 酸 酯 类 标准中间液 B（ 1 g/mL）（3.3.4），按照12.1和12.2步骤与样品同法操作。13 结果判定白色药片区域不变色或略有浅蓝色为阳性结果；白色药片区域变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性

15、结果。通过对比空白和样品白色药片区域的颜色变化进行结果判定。目视判定示意图见图1。13.1 无效白色药片区域干燥，表明取样量偏少，检测结果无效。13.2 阴性样品白色药片区域颜色比空白对照卡颜色颜色相当或为天蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留低于方法检测限，判定为阴性。13.3 阳性样品白色药片区域不变色或略有浅蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲酸酯类农残高于检测限，判定为阳性。图1 目视判定示意图713.4 质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。14 结论当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。15 性能指标15.1 检

16、测限：敌百虫 0.1 mg/kg，丙溴磷 0.5 mg/kg，灭多威 0.2 mg/kg，克百威 0.02 mg/kg，敌敌畏 0.2 mg/kg。15.2 灵敏度：灵敏度应95%15.3 特异性：特异性应85%。15.4 假阴性率：假阴性率应5%。15.5 假阳性率：假阳性率应15%。注：性能指标计算方法见附录 A。16 其他葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，采取整株蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在

17、使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。本方法参比标准为 NY/T 7612008 蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定。8附录A快速检测方法性能指标计算表表 A.1 性能指标计算方法检测结果 b样品情况 a阳性 阴性 总数阳性 N11 N12 N1.=N11+N12阴性 N21 N22 N2.=N21+N22总数 N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或 N.1+N.2显著性差异( 2) 2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）

18、=1灵敏度(p+，%) p+=N11/N1.特异性 (p-，%) p-=N22/N2.假阴性率(pf-，%) pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率(pf+， %) pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，% c (N11+N22)/(N1.+N2.)注：a 由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；b 由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11 表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行， N.2 表示所有的第二列； N12 表示第一行，第二列。c 为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法负责起草单位：山东省食品药品检验研究院。验证单位：南京工业大学食品与轻工学院、深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心。主要起草人：胡明燕、胡梅、王骏、熊晓辉、岳振峰9