1、血小板活化与流式细胞仪分析上一页上一页 下一页下一页返回返回PLT activation 研究生免疫学研究生免疫学 POWERPOINT讲稿讲稿流流式式专专题题制作：姚新生 审 校： 孙 万邦 联 系： ;0852-8204419 8562206血小板活化= 使用流式细胞仪，同时分析血小板多个活化指标 ， 灵敏、特异地检测全血中的血小板，了解血小板的反应性和活化进程= 血小板表面膜糖蛋白（ GP）： PAC-1= 颗粒膜 GP的表达量变化： CD62P= 直接使用全血，样本更接近生理状况= 操作步骤简便、用血量少、避免体外活化与血小板亚群丢失= 血小板减少患者也能精确分析上一页上一页 下一页下
2、一页返回返回PLT activation 研究生免疫学研究生免疫学 POWERPOINT讲稿讲稿流流式式专专题题制作：姚新生 审 校： 孙 万邦 联 系： ;0852-8204419 8562206血小板活化的三色荧光分析= 使用 PerCP标记的泛血小板抗体 CD61， 特异地测血小板表面的活化指标，避免碎片等非特异干扰= 选择活化血小板特异的表面标记 PAC-1，CD62P， 检测血小板活化的不同阶段= PAC-1 FITC： IgM型抗体，是血小板活化的早期标志，即活化的血小板膜糖蛋白复合物。= CD62P PE： IgG1型抗体，是血小板活化后颗粒释放的标志上一页上一页 下一页下一页返
3、回返回PLT activation 研究生免疫学研究生免疫学 POWERPOINT讲稿讲稿流流式式专专题题制作：姚新生 审 校： 孙 万邦 联 系： ;0852-8204419 8562206标本采集h 枸橼酸钠抗凝采血管顺序编号h 抽取静脉血 ，前 2ml弃去不用h 抗凝管中注入 2ml静脉血，轻轻混匀h 10分钟内完成血小板的激活和染色操作h 操作过程中注意减少人工激活血小板h 为评估血小板活化试验的有效性，采用正常人标本做平行阴性对照，正常人 ADP激活标本做平行阳性对照上一页上一页 下一页下一页返回返回PLT activation 研究生免疫学研究生免疫学 POWERPOINT讲稿讲稿
4、流流式式专专题题制作：姚新生 审 校： 孙 万邦 联 系： ;0852-8204419 8562206血小板体外活化h 血小板激活剂 ： ADP， 活化终浓度0.2uMh 试管内加入 50ulADP， 450ul抗凝全血h 轻轻混匀h 37C温育 5分钟h 立即进行染色上一页上一页 下一页下一页返回返回PLT activation 研究生免疫学研究生免疫学 POWERPOINT讲稿讲稿流流式式专专题题制作：姚新生 审 校： 孙 万邦 联 系： ;0852-8204419 8562206荧光染色h Falcon管顺序编号，阴性对照为正常人未活化标本，阳性对照为正常人活化标本h 每一标本作 2管：
5、对照管和试验管h 加入相应 BDIS抗体及对照各 10ulBDIS抗体 FITC PE PerCP对照管 PAC-1+RGDS IgG1 CD61试验管 PAC-1 CD62P CD61上一页上一页 下一页下一页返回返回PLT activation 研究生免疫学研究生免疫学 POWERPOINT讲稿讲稿流流式式专专题题制作：姚新生 审 校： 孙 万邦 联 系： ;0852-8204419 8562206荧光染色h 对照管和实验管中各加入血标本 5ulh 轻轻混匀，室温暗处孵育 20分钟h 各管中分别加入 2-8 C 1% 多聚甲醛1ml， 充分混匀，于 2-8 C暗处固定 10分钟h 24小时
6、内上机，获取数据，分析结果上一页上一页 下一页下一页返回返回PLT activation 研究生免疫学研究生免疫学 POWERPOINT讲稿讲稿流流式式专专题题制作：姚新生 审 校： 孙 万邦 联 系： ;0852-8204419 8562206流式细胞仪测定h 检查鞘液筒和废液筒，打开流式细胞仪h 做 FACSComp， 校正仪器h 打开 CELLQuest软件，顺序摆放试验管h 调出获取条件， FSC和 SSC选择 Log模式， FSC-SSC点图中出现血小板细胞群h FL3设阈值，获取条件为 CD61阳性h 在 FL1-FL2点图中， 对照管目标细胞群位于左下脚h 获取对照管及试验管的数
7、据上一页上一页 下一页下一页返回返回PLT activation 研究生免疫学研究生免疫学 POWERPOINT讲稿讲稿流流式式专专题题制作：姚新生 审 校： 孙 万邦 联 系： ;0852-8204419 8562206流式细胞仪分析h CD61 vs SSC点图中设门，找到 CD61阳性的血小板群h 门内做 PAC-1 vs CD62P点图，进行双参数分析h 结果统计： PAC-1+， PAC-1+CD62+，CD62+ %PLT上一页上一页 下一页下一页返回返回PLT activation 研究生免疫学研究生免疫学 POWERPOINT讲稿讲稿流流式式专专题题制作：姚新生 审 校： 孙 万邦 联 系： ;0852-8204419 8562206流式细胞仪测定
