1、实用组织化学技术,中国医科大学法医学院张国华,细胞化学和组织化学cytochemistry and histochemistry是以细胞学、组织学为基础，运用物理的和化学的技术方法显示细胞组织结构中各种化学成分，并对这些化学物质进行定性、定位、定量（半定量），从而分析研究生物在生理或病理状态下细胞组织的代谢、机能及形态变化规律。其在医学研究中具有广泛的应用价值。,细胞和组织化学方法其原理是运用已知的化学反应过程使细胞组织内的各种化学物质在原位形成可见的最终有色产物。 光学显微镜观察显微镜细胞组织化学 电子显微镜观察电镜细胞化学 免疫技术方法 免疫组织化学 免疫电镜细胞化学 用细胞和组织化学方法
2、显示细胞组织结构中各种酶的定性、定位、定量酶组织化学酶组织化学宏观酶组织化学 光镜酶组织化学 电镜酶组织化学,细胞和组织化学方法研究的范围1. 组织细胞中的无机物质：主要包括钾、钙、锌、铜、汞等金属；氯化物、磷酸盐等盐类；以及各种无机放射性物质等。2. 组织细胞中的有机物质：主要包括中性脂肪、磷脂类、胆固醇、中性和酸性粘多糖类、糖原、粘液蛋白、淀粉、类淀粉物质、黑色素、脂褐素、胆色素、氨基酸、肽、蛋白质、DNA、RNA、各种维生素等。3. 组织细胞中各种酶类：如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等-蛋白质。,细胞和组织化学方法的设计要求:1. 必须最大限
3、度地保存细胞和组织中各种化学成分和/或酶的活性，以保证定性、定量研究；2. 必须最有效地保持细胞组织固有的形态结构，以保证化学成分和各种酶在细胞组织中的定位；3. 必须掌握被检测的化学物质特性，如水溶性、脂溶性、溶解度及特异反应等；4. 必须掌握被检测各种酶的特性，如酶的功能、酶存在的特定部位、酶反应的适宜温度和酸碱度、酶的特异激活剂和抑制剂、影响酶活性的因素等；5. 必须做对照实验，借助阳性和阴性对照，正确分析实验结果，注意识别假阳性结果。,细胞和组织化学方法的基本技术,取材固定水洗脱水透明浸蜡与包埋切片染色:脱蜡、脱苯、水化、染色、脱水、透明封片,一、取材,基本要求：取材是否正确、恰当，直
4、接影响切片的制作及正确诊断。1取材越快越新鲜越好，防止组织自溶、腐败。2取材刀要锋利，切取时刀口垂直地切取；严禁挤压，严禁用钳镊钳夹，以免使组织或细胞变形造成人为的损伤。3取材大小，一般长l-3厘米，宽1-2厘米，厚度为0.3-0.5厘米。科研用光镜标本不超过1cm 1cm 1cm，电镜标本直径约0.5mm。过大材料在短时间内不易固定透，影响效果。4 要兼顾病变部位与正常部位。 5 尽可能在低温条件下操作，04。,各器官取材方法：脑：取材应能反应出脑各部位的变化，一般采用冠状切面法，全脑包括（桥脑、延脑、小脑和脊髓颈段及脉络丛）。取材部位如下：额极； 中央前后回；海马；内囊； 丘脑； 枕叶；脉
5、络丛；中脑； 桥脑； 延髓； 小脑； 脊髓颈段。取材时要包括软脑膜、室脑膜或软脊膜（刀要锋利）。垂体：取垂体时注意前、中、后叶和垂体柄都要兼顾，从前向后矢状切。,心：一般悄况下将心房、瓣膜、心室一起取下。也可分别取一块病变部位连同正常组织。也可单独取心室肌，乳突肌组织。肺：常规取材应包括左、右两肺（五个肺叶），可根据病变需要决定取材块数，特殊情况下为区别在哪个肺叶上取的材可用形状做标志，在记录时记清楚。肾：取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂，并要求区别左、右肾。胰：常规取胰体部，为长方形必要时加取胰头、胰尾。肝：取长方形或三角形均可，带被膜。脾：取材带被膜。,管腔脏器：取材时注意方向大、小肠：考虑
6、环行肌肉，沿肠管的长轴取（纵切）；食管：以横切面为宜；胃：常规取材以胃底为好；气管：横切、纵切均要有。总之管腔脏器的各层构造都要取到。为了防止标本入固定液后变形，将材料取下后（如剪开的大小肠、胃等组织）将浆膜面铺在滤纸上，然后入固定液内，这样能防止或减少组织受压变形与收缩。,二、组织固定,组织固定的意义：组织固定是做好切片的重要步骤之一，如果首次固定失败，再重新固定也不如一次固定成功好，无法补救。迅速将检材固定能有效地防止组织及细胞发生死后的一系列变化。固定的关键在于取材后尽可能地及时地将取到的材料进行固定，抑制其死后变化的进展，尽力使组织接近于生前状态。另外，在标本制做过程中经过许多步骤，为
7、了防止组织成份的溶解消失，有必要及时转变为不溶性物质，从而有利于保存。,组织固定的目的： 阻止死后变化，防止组织的自溶与腐败。 使组织的结构保存下来，如蛋白质，脂肪、糖元、酶等各种成份与生活时的形态相仿。 便于染色，同时对组织有媒染作用，使不同的组织成份对染料有不同的亲和力，使细胞各部易于受色。 能使组织硬化，为做薄切片打下基础。,组织固定的注意事项： 检材、标本：材料块不能过大； 固定器皿不易过小； 固定液量不易过少，大约是固定材料体积的2040倍。固定液：根据检验目的不同选择不同固定液，如做糖元检查就不能用含水的固定液，做电镜检查就必须用锇酸固定液等。,固定液：用以固定组织的药剂。固定液分
8、为两大类： 单纯固定液：仅由一种药剂组成。 混合固定液（或复合固定液）：由二种以上的药剂组成的固定液。固定液选择标准：具有强的穿透力，固定均匀，能迅速渗透组织内部，使组织细胞结构保持生活时期的相仿状态。不使组织过度收缩与膨胀而变形。能迅速使组织中的蛋白质，糖、脂肪等物质凝固而成为不溶性物质。使组织达到一定的硬度，便于切片制作、染色。X价格便宜，容易买到，同时要配制方便。,常用的单纯固定液乙醇（酒精）alcohol 甲醛（福尔马林）（缓冲液配制） formalin重铬酸钾 potassium bichromate 苦味酸 picric acid锇酸 osmic acid 丙酮 acetone 冰
9、醋酸 glacial acetic acid 多聚甲醛缓冲固定液 paraformaldehyde戊二醛磷酸缓冲固定液 glutaric dialdehyde,5. 多聚甲醛缓冲固定液 paraformaldehyde多聚甲醛 4g，加入0.1mol/L磷酸缓冲液 pH7.2 100ml中，加热6080溶解。固定15min24h,04。主要用于科研组织标本的固定，尤其用于免疫组织化学染色的组织固定，保护抗原决定簇不被封闭。6.戊二醛磷酸缓冲固定液 glutaric dialdehyde 25%戊二醛10ml，加入0.1mol/L磷酸缓冲液 pH7.27.4 90ml中。固定时间为60min,
10、04。主要用于科研组织标本的固定，尤其用于电镜超薄切片的小组织块标本的初固定。,组织固定方法,1. 原位固定法在活体情况下，采用快速边取材边滴加固定液，取出标本后再浸泡固定30min-1h，以上操作应在0-4下进行。2. 浸透固定法固定液0-4，量应是样品40倍以上，浸泡30-90min或更长。3. 培养细胞和涂片固定法单层细胞培养瓶只需将培养内盖片取出浸透固定即可。悬液培养细胞应离心浓缩后涂片，或离心管内加入固定液2000r/min约20 min离心成团后制作切片。也可以向离心管内加入胶冻再离心，切取离心管尖端胶冻固定。,4. 灌注固定法通过心血管途径将固定剂灌注到全身或某一器官，使生活的细
11、胞在原位迅速固定后再取材，可达到非常好的固定效果，尤其对于脑等需要很长取材时间的器官更有意义。麻醉或颈椎脱臼处死动物后，立即打开胸腹腔和心包，滴溜注射针刺入左心室或主动脉内，剪开右心耳排血，立即用含有适量肝素的生理盐水或缓冲液灌注，清洗血液；然后很快用固定液继续灌注，大小鼠心灌注时其压力约为100-150mmHg，灌流量约为5-10ml/min，灌注时间一般在5-20min左右，一般以观察动物肝质地变硬为准。灌注固定完成后取材，并用固定液后固定2小时。灌注固定快速均匀， 可保存细胞组织的微细结构。,三、水洗,用水道流水洗涤，目的是将组织块中的固定液取代出来，水洗一定要充分。水洗时间数小时至24
12、小时。根据材料多少、大小可灵活掌握水洗工具，可用水洗筐或用纱布包裹，要防止水流大将组织块冲掉或丢失。科研用小材料也可用PBS液多次浸泡洗涤，但要保证至少4-6小时的洗涤时间。,四、脱水,组织块固定后虽然已经硬化，但达不到切薄片的硬度，必须进行除固定液以外的其它处理，脱水就是继固定后的重要步骤。经固定和水洗后的组织含大量水份，在这种情况下首先必须除去组织内部的水份，这种除水的过程叫做脱水，脱水使用的药剂称为脱水剂。脱水必须逐渐依次从低浓度酒精开始到高浓度酒精，否则会引起组织强烈收缩变脆，不利制片，但脱水不彻底也很难浸蜡。,常用脱水剂：酒精、丙酮、正丁醇等。1. 酒精一股是从70酒精开始，经809
13、095100I一100II，每步骤脱水时间根据材料大小而灵活掌握，一般数小时到12小时，更换一次酒精。无水乙醇不适合用来配低浓度酒精，价格较贵。取95酒精70ml加蒸馏水25ml，配成70酒精95ml。80酒精取95酒精80ml加蒸馏水至95ml即可，依次类推。2. 丙酮脱水作用与酒精相似，虽然其脱水作用比酒精强，但对组织块的收缩较严重，且价钱较贵，故不宜用于一股组织脱水。丙酮既有脱水作用，又有透明作用。用丙酮固定的材料要小，脱水1一8小时即可。,五、透明,组织块脱水后需要透明，因为水与蜡不能相交换，需要借助石蜡诱导剂的过渡。石蜡诱导剂渗入之后组织块往往呈现透明状态，习惯上将石蜡诱导剂渗入组织
14、内的过程叫透明，而这种药剂称为透明剂。透明的时间依组织块的大小而定，一般采用20分钟至1小时左右，如组织块过大可延长透明时间，透明好的材料如同油炸的感觉，呈透明状。,最常用的透明剂为二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。二甲苯：是无色透明的一种有机溶媒，有很强的刺激气味，易挥发，长期接触对粘膜有刺激作用。二甲苯透明组织的作用很强，可使组织收缩变形，故透明时间不宜过长。透明过程中如遇到组织块内部或某一个部位呈白色混浊状态时，说明脱水不彻底，进而造成透明不彻底，无法下一步浸蜡。应退回到100酒精中重新彻底脱水。,六、浸蜡与包理,浸蜡的目的是为了能制备一菲薄的切片做准备。将透明好的组织块浸到石蜡中，使石蜡渗
15、透到组织细胞内，将组织细胞内的二甲苯完全彻底地取代出来，然后再用石蜡将组织包埋起来，冷却后，切成小块，修整好切面，再用切片机切极薄的切片，将这一过程称为浸蜡与包埋。,蜡的种类：主要有两类： 蜂蜡：是动物体内提取的蜡，颜色微黄，故也称为黄蜡，溶点在54左右。特点是润滑带有粘性，冬天用量比夏天多。 石蜡：是由矿物质中提取，质地较疏松，色白。根据蜡的溶点不同又可分为软蜡及硬蜡： 溶点在50以下的石蜡称为软蜡。溶点在50以上的石蜡称为硬蜡。两种蜡可以掺合在一起使用（没条件的情况下可用蜡烛来代替）。上海生物制品厂出的石蜡熔点有5254，5658，5860，6062这几种。,2 . 包埋：包埋的方法多种，
16、最常用的是石蜡包埋法。除此之外还有火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、明胶包埋法及环氧树脂包埋法（电镜用）。冰冻切片采用水包埋法或特殊专用包埋剂包埋等。包埋时用纯石蜡溶解后（60）倒入包埋框内，迅速将浸好的组织块依次摆入框内，待蜡逐渐冷却凝固后就将组织材料一并凝结在石蜡内。包埋时组织块的切面向下、放平。如果操作不熟练或在冬天包埋时最好有一酒精灯，在材料包入石蜡之前稍在酒精灯上过一下（稍加一下温），以免材料与包埋蜡温度不符造成材料与包埋蜡有一痕迹，切片时产生分离现象。蜡块上要烫上标记年号例号等字样的纸片以长期保存，切完的蜡块表面要用烫片板烫一下，封闭材料面，隔离空气接触，可长期保存材料不干。目前主要在包埋
17、机上操作，方便、快捷。,七、切片,1、载玻片的准备、粘附剂的使用：.商品化准备好的载玻片：两端带有“”标志，无须处理，直接使用；比较昂贵；.常规载玻皮的处理：铬硫酸浸泡24小时，流水冲洗12小时，蒸馏水洗3遍，烘干，备用；玻片较干净时，也可用稀盐酸浸泡。 蛋白甘油：用鸡蛋清（不要鸡蛋黄）用玻璃棒充分搅拌后用数层纱布过滤后加等量的甘油搅均匀加数颗麝香草酚（防腐）。载玻片上薄层涂抹后晾干，备用。主要用于常规组织学、组织化学染色用。,多聚赖氨酸（poly-L-lycine, PLL） 多聚赖氨酸（M.W=300kD） 0.5g 蒸馏水 100ml配制方法：称取多聚赖氨酸，配制0.5%的水溶液，充分混
18、合即可。也可适当稀释配成0.01%-0.5%浓度。4保存，也可在-20备用。多聚赖氨酸可反复冰冻，效果无大影响。工作液常用稀释10-50倍。主要用于免疫组织化学、原位杂交、TUNEL染色等。,APES粘片剂（Vectabong试剂）（3-Amino propyltriethoxy silane）是一种新型玻片粘附剂，通过对玻璃表面的化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地粘贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒7ml可配成350ml（丙酮）工作液。 程序：干净载玻片丙酮5min APES(1ml+50ml丙酮），将玻片用镊子夹住浸入APES试剂1-2次纯丙酮洗2
19、次干燥，37过夜用铝箔包好，RT存放，备用。铬矾明胶液（略）甲醛-明胶液（略）注意：备用载玻片均要避免污染（尤其注意防尘）； 一般可保存半年以上。,2、制作切片需要的工具：切片刀、磨切机、水浴锅、干燥箱或烤片机（可用蜡箱代替使用）。还需载玻片、手术刀、毛笔一支、弯镊子一个、托盘一个、大平皿一个、（展片使用）烤片盒或烤片架、蛋白甘油等。切片机：1. 切片机种类：有轮转式切片机，滑行式切片机（滑动式），冰冻切片机，超薄切片机（电镜用）等；2. 构造：任何一个类型的切片机都是由四个基本部分组成：刀台；标本台；旋转轮；控制切片厚度的微动装置（标有 l25或1一50的数字，每一数字代表一个微米用来显示）
20、。可根据需要厚度来调节，一般组织片都采用7。以上四部分共装在一个铁制的台坐上，这样就组成了各种类型的切片机，最常用的是石蜡切片机。,切片操作：将切割修整好的蜡块用普通刀片先将蜡块切面暴露出来、修平，固定在切片机标本台上并拧紧螺旋。切片刀固定于刀台上，拧紧固定刀的螺丝，同时调整刀与蜡块的切片距离，使刀与蜡块贴紧后再固定刀台螺丝，刀的角度为25度角。调节微动装置，调至切片所需厚度（一般为 6-7微米）修材。右手握旋转轮摇把，按顺时针方向均匀地摇动直到组织块切面完整为止。如果以上各部操作正常，此时能切出一条完整的连续的蜡带，用毛笔轻轻将蜡带顺刀口挑下，放在托盘内待用。,3、水浴锅展片、捞片通电后将平
21、皿内水温升至45左右，将已切好的薄片切割数片轻漂水中展平，不平时可用小弯镊子轻轻展平，然后用涂有蛋白甘油等粘附剂的载片在水中选择完整的切片以一定角度进行捞片。注意事项： 1切片刀要锋利，否则切片有切痕或组织破碎，甚至切不下来。2展切片时水温要适当，水温低展不平切片，影响效果，有皱折；水温过高切片入水后蜡片及组织熔化。,八、染色,染色前准备工作染色用的工具：12个染色缸或者盛各种不同浓度的酒精染色筐广口瓶，染色缸及脱蜡、透明用的各二个二甲苯缸，盖片，带磨口盖的树胶瓶一个，镊子等。,染色需要的试剂及染色液的配制：盐酸酒精：主要是染色分色时用。一般采用0. 51的浓度，即在100ml的7080酒精中
22、加人0.5或者1ml的浓盐酸。 苏木素（Hematoxylin）苏木素为细胞核的染料，不经氧化的苏木素是不具有染色能力的。苏木素的配方很多，一般组织化学染色所配制的苏木素有二类：一类是自然氧化的苏木素，另一类是加入氧化剂加速氧化的苏木素。 伊红（曙红， Eosin）是细胞质最常用的染料之一。外观是红色粉末。分两种，一种是酒溶性伊红，另一种为水溶性伊红。使用前要看说明以免配错。一般组织病理学切片染色，染细胞核用苏木素，染细胞质用伊红，故称之为HE染色（苏木素-伊红染色法）。,染色方法及步骤（以HE染色为例）,1脱蜡，将干燥的切片入二甲苯I 10-20分钟，然后移入二甲苯 10-20分钟。2脱苯：
23、用无水乙醇I 脱苯2-5分钟，再经无水乙醇II 2-5分钟。3水化：再经95908070酒精各1分钟，入蒸馏水浸洗数分钟，每步操作要轻。4染细胞核，将切片移入苏木素染液中染10-20分钟。5水洗（水洗一下，将浮在表面的染液去掉）。6l盐酸酒精分化，时间几秒钟，肉眼观察切片组织材料呈粉红色即可。,7兰化：水道流水洗（半小时-24小时），切片从粉红色转变为鲜艳的兰色，这过程也称为兰化的过程。必要时放入氨水的低碱液中浸几分钟。8染细胞质：用0.5或者l伊红水溶液进行染色，1-5分钟。9切片脱水：是由低浓度酒精到高浓度酒精。将切片入70809095酒精，时间几秒钟，时间长了，伊红易脱色，注意伊红与苏木素的对比染色的色调适合。10彻底脱水，100酒精I 510分钟，再入100II酒精 510分钟。11. 透明：入二甲苯I 25分钟，再入二甲苯II 25分钟。,
