1、本科毕业论文（设计）题 目：喹啉双季铵盐与小牛胸腺 DNA 的作用研究目 录摘要 .II关键词 .IIAbstract.IKeywords.错误！未定义书签。1 绪论 .21.1 BZQN 的结构特征及生物效应 .21.2 DNA 的结构特征与生理作用 .31.3 本课题的研究方法 .31.4 本课题研究的主要内容、目的及意义 .42 实验部分 .52.1 实验仪器与试剂 .52.2 实验内容 .63 结果与讨论 .83.1 BZQN 对 ctDNA 的紫外吸收光谱的影响 .83.2 荧光光谱 .93.3 碱变性实验 .123.4 金属离子对 BZQN 与 DNA 相互作用的影响 .133.5
2、 热变性实验 .143.6 BZQN 对 DNA 的结构影响 .153.7 BZQN 与 DNA 相互作用的焓变 .173.8 分子模拟 .184 结论 .19参考文献 .20喹啉双季铵盐与小牛胸腺 DNA 的作用研究摘要：本论文采用圆二色谱法、等温滴定量热法、分子模拟、荧光光谱法等方式研究了喹啉双季铵盐(BZQN)与小牛胸腺 DNA(ctDNA)的相互作用机理及热力学。研究结果表明，BZQN 具有显著的荧光，在 340nm 激发，470nm 发射；随着DNA 浓度的增加，BZQN 的荧光发生明显的猝灭，并且猝灭常数（K sv）随着温度的升高而增大，符合动态猝灭的特征；紫外可见光谱实验、热变性
3、实验及圆二色谱结果均表明，BZQN 与 DNA 发生嵌插结合，从而导致 DNA 的二级结构发生改变；离子选择性实验表明 K+ 使 BZQN-DNA 体系的荧光发生最显著的猝灭；分子模拟的结果表明，BZQN 可能是以静电作用方式结合在 DNA 大沟附近；等温滴定量热实验表明 BZQN 与 DNA 的结合位点数约为 4，推测 BZQN 与 DNA的结合是熵驱动过程。综合以上实验结果可以推断，BZQN 与 DNA 能发生熵驱动的相互作用，其作用模式既有嵌插作用又有静电作用，且静电作用占主导。关键词: 喹啉双季铵盐；小牛胸腺 DNA；光谱法；等温滴定微量热；分子模拟 Study on interact
4、ion of quinoline biquaternary ammonium salt with calf thymus DNAAbstract: In this paper, the interaction and thermodynamics of quinoline biquaternary ammonium salt (BZQN) with calf thymus deoxyribonucleic (ctDNA) was investigated by circular dichroism (CD), isothermal titration calorimetry (ITC), mo
5、lecular simulation and fluorescent spectrometry. The results showed BZQN had significant fluorescence at 470nm when it was excited at 340nm. Its fluorescence was quenched by ctDNA and the quenching constant (Ksv) was increased as the temperature rose, which was fitted the characteristics of dynamic
6、fluorescence quenching. The results of UV spectra, thermotropy experiment and CD spectra indicated that the secondary structure of DNA had been changed because of the intercalation effect between BZQN and DNA. The effect of different metal ions on BZQN-DNA showed that the fluorescence of BZQN-DNA wa
7、s sharply quenched by K+, but other cations had a little influence. The molecular simulation indicated that BZQN was bound to DNA near the big ditch by electrostatic interaction. By means of ITC, the binding point between BZQN and DNA was 4 and the combination process of BZQN and DNA was driven by e
8、ntropy. So the binding mode of BZQN to DNA both included the intercalation and electrostatic effects, and the electrostatic effect was the dominant. Keywords: Quinoline biquaternary ammonium salt; Calf thymus DNA; Spectroscopy; Isothermal titration calorimetry; Molecular simulation1 绪论1.1 BZQN 的结构特征
9、及生物效应 1.1.1 BZQN 的结构特征 喹啉是杂环芳香性有机化合物，分子式是 C9H7N，微溶于水，易发生取代反应，因此可以在喹啉环的基础上通过修饰母体结构改善水溶性，连接不同的取代基实现其不同的生物功能。基于此，本论文通过喹啉环上的苄溴取代反应合成了喹啉双季铵盐（BZQN），其结构如下图所示：(R)-(6-methoxy-quinonine-4-yl)(2S,4S,8R)-8-vinylquinuclidin-2-yl)methanol1.1.2 BZQN 的生物效应 喹啉类化合物属于芳香杂环类化合物，多种药物及具有药理活性的天然产物中都存在喹啉结构的骨架，由于其易发生亲电取代反应，可
10、以连接不同的基团形成不同功能的衍生物，因此喹啉类化合物在医药及分子生物学等领域都有重要的应用，尤其在抗疟疾、肿瘤、结核、HIV 病毒等领域具有突出的作用，是药物研究的一个焦点。自从 20 世纪 30 年代人类认识到喹啉类化合具有抗疟疾的作用以来，对喹啉类化合物的研究从未停止过，孙业欣等人全面综述了近十年来喹啉类化合物在抗疟方面的研究进展 1；冷元红等人对喹啉类及其衍生物的抗疟药物的合成及推广作了简要介绍，同时阐述了其中几类药物的作用机理 2；Hoppe HC 等人通过分子示踪法研究了喹啉药物氯喹和甲氟喹在恶性疟原虫的内吞作用，分析发现氯喹抑制血红蛋白消化但没有其他重要影响寄生虫的内吞作用的途径
11、，而甲氟喹抑制内吞作用效果显著 3；刘春亮等人通过小鼠肝癌模型及免疫学实验方法研究了吡咯喹啉醌的抗肿瘤作用，结果表明吡咯喹啉醌对靶细胞的杀伤效率很高，具有显著的抗肿瘤生长的效果，同时口服给药时能够提高机体的抗肿瘤免疫功能 4；应苗法等人通过动物实验和临床实验均证实了贝达喹啉能够特异性的抑制结核杆菌的 ATP 合酶发挥作用，对耐药和非耐药的结核杆菌都有效 5；霸明宇等人采用细胞水平模型、酶联免疫吸附法和荧光法研究了 N4-芳基磺酰基喹喔啉酮类化合物抗 HIV-1 作用机制及特点，结果显示该化合物作用于 HIV-1 复制的逆转录环节，抑制了逆转录酶的 RNA 依赖DNA 聚合酶活性，表现出优异的抗
12、 HIV-1 活性 6；李小芳等人采用摩尔电导率、光谱法和热重分析手段研究了镧-磺基水杨酸-8-羟基喹啉三元配合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和真菌黑曲霉的抑菌活性，结果显示该三元配合物对三种真菌均有非常好的抑菌效果 7。1.2 DNA 的结构特征与生理作用 参与 DNA 组成的主要有四种碱基即：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C) 。所有 DNA 中腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔含量相等，即 A=T，鸟嘌呤与胞嘧啶的摩尔含量相等，即 C=G。DNA 的一级结构是由数量及其庞大的四种脱氧核糖核苷酸即：脱氧腺嘌呤核苷酸，脱氧鸟嘌呤核苷酸，脱氧胞嘧啶核苷酸，脱氧胸腺嘧啶核苷酸，通过 3,
13、 5- 磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体。DNA 分子骨架是由反向平行的核苷酸链围绕同一中心相互缠绕，嘌呤和嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与核糖在外侧，彼此通过 3, 5- 磷酸二酯键连接。双螺旋结构上有两条螺形凹沟，一条较深，一条较浅。较深的沟称大沟，较浅的沟称小沟。双螺旋的平均直径为 2 nm，碱基堆积距离为 0.34 nm，沿中心轴每旋转一周有 10 个核苷酸，两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键结合在一起 8。 DNA 是生物体遗传信息存储和表达的载体，对生物体具有重要的意义 9。1.3 本课题的研究方法 圆二色谱法：圆二色谱主要是用于研究生物大分子的结构，通过圆二色光谱获得生物
14、大分子如蛋白质、多糖等的二级结构信息，与分子设计与计算互相验证。可应用于蛋白质折叠蛋白质构象研究，DNA/RNA 反应，糖类等光学活性物质的结构、纯度测量，药物筛选等。研究生物大分子之间的相互作用，大分子与小分子的相互作用，测定分子相互作用后引起的生物大分子结构的变化，进而进行以生物大分子作为靶点活性物的筛选或者研究药物的作用机制。分子模拟：利用理论方法与计算技术模拟或仿真分子运动的微观行为，广泛的应用于计算化学，计算生物学，材料科学领域，小至单个化学分子，大至复杂生物体系或材料体系。分子模拟不仅避免了繁琐的量子力学方程的求解，而且在保证精度的同时，大大扩展了原子的计算机模拟的使用范围。在药物
15、设计领域，可用于研究病毒、药物的作用机理等；在生物科学领域，可用于表征蛋白质的多级结构与性质；在药物研究方面通过分析和计算一系列活性药物分子的三维构象并将其叠合，了解某一类药物分子所应具有的药物构象，这一信息给予新药研究很大帮助，药效构象的计算为今后的药效基团方法以及数据库虚拟筛选的方法打下了基础 10-11。等温滴定量热法：是研究生物热力学与动力学的重要方法，利用高自动化、高灵敏度的微量量热仪连续、准确地监测、记录一个变化过程的热力学、动力学曲线。等温滴定量热法具有许多独特优势：对被研究体系的限制条件少，样品用量小且无损，灵敏度和精确度高，实验时间较短，操作简单。通过测定药物与 DNA 或者
16、 RNA 相互作用，可以获得生物分子相互作用的完整热力学和动力学参数 12-13。荧光光谱法：由于荧光光谱技术具有操作方便，灵敏度高等优点，常用于研究小分子与核酸相互作用。对于本身具有荧光的物质，其荧光性质是研究它与 DNA 相互作用的关键性质。当化合物嵌插入 DNA 后，由于该化合物自身振动模式受到影响，该化合物的荧光强度通常会有所改变。因此，可以依据荧光强度的变化推测该化合物与 DNA 作用的程度及机理。对于本身无荧光的化合物则可以通过溴乙锭竞争实验来研究其与 DNA 的相互作用 8。红外光谱法：红外光谱法实质上是一种依据分子内部原子间的相对振动、分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合
17、物的分析方法。将分子吸收红外光的情况用仪器记录下来，就是红外光谱图，红外光谱图能够显示 DNA 分子中的主链骨架、特征振动谱带以及侧链在 2000-500nm 范围振动谱带等，可以依据 DNA 在加入化合物前后红外图谱的变化来推测该化合物与 DNA 的相互作用 8。1.4 本课题研究的主要内容、目的及意义 DNA 是生物的基本遗传物质，是遗传信息的载体，是基因表达的物质基础，因此 DNA 也是很多类药物的重要靶点。DNA 与药物分子相互作用的研究对药物的设计合成、结构改造及相关的作用机制研究具有重要的意义。喹啉类化合物是一类在医药等领域有着广泛应用的芳香杂环化合物，有关此类化合物的合成及应用近
18、年来受到人们的广泛关注。因此，我们在合成喹啉环的基础上通过修饰喹啉的母体结构，连接不同功能的取代基来实现其不同的生物能，本论文对新合成的喹啉双季铵盐化合物通过紫外、荧光、圆二色谱、等温滴定量热、分子模拟等方式进行结构鉴定和表征，并进一步探讨其与 DNA 间的相互作用。2 实验部分2.1 实验仪器与试剂 2.1.1 实验仪器 本实验所用实验仪器如表 1 所示：表 1 实验仪器仪器 型号 产地瞬态荧光分析仪 FLS920 英国爱丁堡仪器有限公司双光束紫外可见分光光度计 T-1901 北京普析通用仪器有限责任公司圆二色谱仪 Chirascan 英国应用光物理公司pH 计 Sartoris 普及型 北
19、京赛多利斯仪器系统有限公司等温滴定量热仪 Nano 美国 TA 公司傅立叶红外光谱仪 Nicolet-380 美国尼高力公司2.1.2 实验试剂本实验所用实验试剂如表 2 所示：表 2 实验试剂药品 类型 产地ctDNA BR sigma 公司喹啉双季铵盐 曾林涛老师馈赠磷酸二氢钠 AR 天津市天力化学试剂有限公司磷酸氢二钠 AR 天津市天力化学试剂有限公司氯化钠 AR 国药集团化学试剂有限公司氯化钾 AR 武汉市江北化学试剂厂2.2 实验内容 2.2.1 圆二色谱 DNA 是光学活性物质，因此可测定它的圆二色谱，从而了解其构象。实验所用仪器为 Chirascan 圆二色谱仪，光源系统用氮气保
20、护(流量为 5 L/min)，样品池的光径为 0.5 mm。测量参数：扫描速率 100 nmmin-1 ，分辨率 0.1 nm，响应时间 1 s，累积次数 3 次。扫描波段为 200320 nm，DNA 的浓度为 0.3 g/L。实验时在样品池中放置 90 L 2.1710-5 mol/L 的 DNA 溶液，加入 9 L 1.1310-3 mol/L BZQN 溶液，测溶液的 CD 谱。2.2.2 分子模拟本实验采用 SYBYL 8.1 软件，SYBYL 是美国 Tripos 公司为从事药物及相关领域研究的用户提供的全面的药物设计工具，是目前药物设计方面的权威工具软件。在 SYBYL-X 软件
21、包中有着当今最先进、最现代的同源建模技术与工作流，同源蛋白识别、从序列预测结构与功能、配体结合位点分析以及 3D 建模技术等，用来解决诸如生物大分子建模以及生物信息学分析之类的结构生物学设计任务。不论是进行配体 - 受体的相互作用的理论计算，还是依据生物大分子的结构设计新配体，都是把配体对接到受体的结合部位去，形成配体 - 受体复合物，这个过程即为分子对接 11。在进行分子对接时，首先是以已知配体5-乙氧羰基 -6-甲基-4-4-甲氧基苄基-3,4-二氢嘧啶-2(1H)-酮(EMMD)与受体ctDNA 的晶体结构为基础，计算受体 ctDNA 结合部位的表面性质；然后删去原来的配体 EMMD，计
22、算用于分子对接的新配体 BZQN 的各表面性质，然后依据互补匹配原则，将配体 BZQN 对接到受体 ctDNA 的结合部位上去。2.2.3 等温滴定微量热BZQN 与 DNA 作用的热力学焓变由美国 TA 公司的 Nano ITC3G 采用连续注射的方法完成，用仪器自带 Nano ITC Analyze 软件进行数据采集和处理。具体实验过程为：将 250 L 1.1310-4 mol/L 的 BZQN 溶液装入 250 L 滴定针，设定总的滴定次数为 25 次，每次滴 10 L 于 1.00 mL 2.1710-5 mol /L DNA 溶液中；连续滴定时间间隔为 300 s，每次滴定持续时间
23、为 2 s。2 次滴定实验的时间间隔大约 45min，使信号有足够的时间返回基线。测量池的温度控制为 25 oC，安培瓶中搅拌器的转速固定在 350 r/min，等基线稳定后再启动实验，以便使因搅拌而产生的热量被自动扣除。为扣除 BZQN 和 DNA 的稀释热，要进行空白实验。2.2.4 紫外光谱实验小牛胸腺 DNA 用 PBS 稀释，采用文献所述方法 14，将 0.01 g/L ctDNA 在紫外吸收光谱 260 nm 处，根据文献中摩尔吸收系数 2606600 Lmol -1cm-1，可以确定其浓度为 2.210-5 mol/L，溶液保存于 4C 的冰箱中备用。取 2 mL 2.1710-
24、5 mol/L ctDNA 溶液于比色皿中，相应的试剂 PBS 做参比，测试溶液紫外吸收强度做空白对照，加入 5 L 7.510-1 g/L BZQN 溶液，测试溶液紫外吸收强度，重复 10 次。在 25 oC 时，测试 2 mL 2.4410-5 mol /L ct DNA 溶液紫外吸收强度。将恒温槽升温至 35 oC (35-95 oC 间、每隔 5 oC 的温度，总共 12 组温度)，重复测试溶液紫外吸收强度。然后在 2mL 2.4410-5 mol/L ct DNA 溶液中加入 2 L 5.6310-4 mol/L BZQN 溶液混合，重复上述过程。2.2.5 荧光光谱实验取 2 mL 2.2510-5 mol/L BZQN 溶液于比色皿中，测试溶液的荧光强度做空白对照，加入 5 L 1.0810-3 mol /L ctDNA 溶液，测试溶液的稳态荧光强度，重复 10 次。在初始激发波长为 490 nm，350 - 470 nm 之间记录发射光谱，间距为 10 nm 的条件下，分别扫描 BZQN 和 BZQN-ctDNA 体系的三维荧光光谱，其中BZQN 的浓度为 2.6310-5 mol/L，BZQN-ctDNA 体系 ctDNA 的浓度为 1.5210-6 mol/L。
