1、一种新型杀菌剂制备及性能研究 一种新型杀菌剂制备及性能研究 完成日期： 指导教师签字： 答辩小组成员签字： 一种新型杀菌剂制备及性能研究 1 一种新型杀菌剂制备及性能研究 摘要 本论文对高分子质量的壳聚糖进行分子修饰，在水浴条件下使一定量的壳聚糖、二甲基亚砜和碘甲烷在碱性环境中反应适当时间，合成一种 N 上取代季铵盐的壳聚糖抗菌剂，季铵盐壳聚糖。所得水溶性季铵盐壳聚糖（ TMC）采用傅里叶红外光谱检测（ FT-IR）进行表征和分析。研究 TMC 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性能，以未修饰的壳聚糖作为对照。结果表明： TMC 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有一定的抑菌效果，而壳聚糖对两种受试菌
2、则没有明显的抑菌效果。针对 TMC 筛选出中和试剂，卵磷脂。研究 TMC 与细菌接触作用 5分钟， 10分钟，15 分钟和 20 分钟时的抑菌效果。结果显示：接触时间越长， TMC的抑菌效果越好。本项研究对更好的开发利用季铵盐壳聚糖，使其成为成熟的杀菌剂具有十分重要的意义。 关键词：壳聚糖；季铵盐；杀菌剂；中和剂 一种新型杀菌剂制备及性能研究 2 The Preparation of A New Fungicide And Its Properties Abstract In this paper, the polymer molecular mass of chitosan modified
3、 conditions under the water bath a certain amount of chitosan, dimethyl sulfoxide and methyl iodide an appropriate time in an alkaline environment, the synthesis of an N-substituted season ammonium salt of chitosan antimicrobial agent, a quaternary ammonium salt of chitosan. The resulting water-solu
4、ble quaternary ammonium salt of chitosan (TMC) using Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) were characterized and analyzed. Study on the antimicrobial properties TMC Escherichia coli, Staphylococcus aureus, unmodified chitosan as a control. The results showed that: TMC for Escherichia coli
5、 and Staphylococcus aureus has certain inhibitory effect, while the two tested bacteria Chitosan is no significant inhibitory effect. TMC screened for neutralizing agents, lecithin. Research TMC contact with bacteria for 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes and antibacterial effects of 20 minutes. The
6、results show: The longer the contact time, the better inhibitory effect TMC. Study for a better exploitation of the quaternary ammonium salt of chitosan, making it a proven fungicide has very important significance. Key words: chitosan; quaternary ammonium salt; germicide; neutralizing agent 一种新型杀菌剂
7、制备及性能研究 3 目 录 0 前言 . 4 1 实验材料及仪器 . 6 1.1 实验材料与试剂 . 6 1.2 实验仪器 . 6 2 实验方法 . 8 2.1 季铵盐壳聚糖的合成 . 8 2.2 壳聚糖和季铵盐壳聚糖物的红 外光谱表征 . 8 2.3 季铵盐壳聚糖的抑菌性能检测 . 8 2.3.1 培养基的配制及试剂的准备 . 8 2.3.2 菌株接种与培养 . 9 2.3.3 测定与分析 . 10 2.4 季铵盐壳聚糖中和剂的筛选 . 10 2.5 季铵盐壳聚糖的抑菌 效能评价 . 11 3 实验结果分析 . 12 3.1 季铵盐壳聚糖物的红外光谱表征 . 12 3.2 季铵盐壳聚糖的抑菌
8、性能检测 . 12 3.3 季铵盐壳聚糖中和剂的筛选 . 14 3.4 季铵盐壳聚糖的抑菌效能评价 . 15 3.4.1 季铵盐壳聚糖对 金黄葡萄球菌的抑菌效能 . 15 3.4.2 季铵盐壳聚糖对大肠杆菌的杀菌效能 . 17 4 总结 . 19 4.1 论文主要结论 . 19 4.2 存在的问题与可持续研究的问题 . 19 4.3 季铵盐壳聚糖作 为杀菌剂的前景展望 . 19 参考文献 . 20 致谢 . 22 一种新型杀菌剂制备及性能研究 1 0 前言 自然界中存在大量的有害微生物，不仅危害人们的健康，而且引起各种材料的分解、变质和腐败，危害环境和工农业生产，带来重大经济损失 1。阻止有害
9、微生物，目前最有效的方法是依靠化学试剂，也就是杀菌剂 2。 杀菌剂又称杀生剂、杀菌灭藻剂、杀微生物剂等，通常是指能有效地控制或杀死水系统中的微生物 细菌、真菌和藻类的化学制剂 3。 壳聚糖（ CS）是一类资源丰富的天然氨基多糖，可由广泛存在于节肢动物外壳和真菌类细胞壁中提取的甲壳素经脱乙酰化制得， 具有良好的生物降解性、生物相容性，且无毒副作用 4，其优越的生物活性功 能、良好的成膜特性和较强的抗菌防腐保鲜能力已引起国内外研究人员的广泛关注和重视 5。但是壳聚糖 由于分子中含大量的 -OH 和 -NH2，形成复杂的氢键作用，只能在酸性条件下使用，而且壳聚糖不溶于水 及 大部分有机溶剂，抑菌应用
10、场合受到了很大的限制 6。 季铵盐类化合物于 1915 年首次合成，继而发现该化合物有一定的杀菌作用7。经进一步研究表明，季铵盐的氨基能够与微生物的细胞膜发生静电吸附作用 ，从而可以 杀灭细菌、真菌和病毒 8。季铵盐化合物以其广谱高效的杀菌性能，以及使用范围广、水溶性好、性质稳定、安全低毒、价 格便宜等诸多优点 ， 在自然环境、医院消毒、机械设备的表面和防生材料等方面具有非常广泛的应用 9。 后经实验证明，如果在壳聚糖分子上引入季铵盐侧链，就可以增加正电荷的数量，从而大大改善它的水溶性，并且具有 更强的抑菌 能力，对革兰氏阳性菌和阴性菌均显示出较好的抑菌效果 10。 在自然环境、医院消毒、机械
11、设备的表面和防生材料等方面具有非常广泛的应用。因此 季铵盐壳聚糖作为一种生物杀菌剂具有广阔的 应用 价值 11。 经过研究发现，虽然季铵盐类消毒剂抑菌作用强大，但在杀菌试验中必须有效去除残留药物的干扰，才能真实地检测出其实际杀菌效果，此问题一直没有得到很好解决。随着消毒剂配方越来越复杂，残留消毒剂的去除已成为评价此类消毒剂的技术难题 12。 一种新型杀菌剂制备及性能研究 5 本论文拟合成一种季铵盐壳聚糖，检测 季铵盐壳聚糖对不同菌种的抑菌效果 ，研究季铵盐壳聚糖 水溶液 的稳定性， 验证 其是否可以作为一种生物抑菌剂 ，同时筛选 出针对季铵盐壳聚糖 杀菌剂 的中和剂，为 产品 开发奠定理论基础
12、。 一种新型杀菌剂制备及性能研究 6 1 实验材料及仪器 1.1 实验材料与试剂 季铵盐壳聚糖：由本实验室自行制备； 壳聚糖 分析纯 购于青岛宏海生物技术有限公司； 碘甲烷 分析纯 购于上海山浦化工有限公司； 二甲基亚砜 分析纯 购于天津市广成化学试剂有限公司； 磷酸氢二钠 分析纯 购于江苏强盛化工有限公司； 盐酸 分析纯 购于莱阳经济技术开发区精细化工厂； 蛋黄卵磷脂、营养琼脂粉、营养肉汤粉 购于北京奥博星生物技术有限责任公司； 氢氧化钠、乙醇 购于国药集团化学试剂有限公司； 培养基：（ 1）液体培养基：使用营养肉汤粉和蒸馏水配制成浓度为 1.9%（ w/v）的液体培养基； （ 2）固体培养
13、基：使用营养琼脂粉和蒸馏水配制成浓度为 3.3%（ w/v）的固体培养基； 菌株：（ 1）金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus， S.aureu）； （ 2）大肠杆菌（ Escherichia coli， E.coli） ,均由本实验室提供 1.2 实验仪器 电子天平 型号： AB104-N 上海美特勒托利多公司 振荡培养箱 型号： HZQ-X100 哈尔滨市东电子技术有限公司 磁力搅拌器 型号： RO10 德国 IKA 公司 电热恒温培养箱 型号： DHP-9052 上海齐欣科学仪器有限公司 垂直流桌上型超净工作台 型号： SCW-CZ-650 苏州宏瑞净化科技有限公
14、司 集热式恒温加热磁力搅拌器 型号： DF-101S 河南省予华仪器有限公司 一种新型杀菌剂制备及性能研究 7 立式压力蒸汽灭菌锅 型号： GI45DS 上海博讯实业有限公司 傅立叶红外光谱仪 型号： Nicolet-380 美国热电集团 移液器 德国 Eppendor 公司 数显酸度计 奥豪斯仪器（上海）有限公司 冻干机 美国 SIM有限公司 一种新型杀菌剂制备及性能研究 8 2 实验方法 2.1 季铵盐壳聚糖的合成 15%NaOH 溶液的配制：称量 3g 氢氧化钠，溶于 17ml水中，配制成氢氧化钠溶液。 准确称取 2g壳聚糖粉末加入装有 12ml 15% NaOH 溶液的平底烧瓶中，室温
15、溶胀 10min，然后加入 80ml 二甲基亚砜、 12ml 碘甲烷， 60水浴加热，反应 60分钟。 60 分钟后，再往烧瓶中加入 6ml 15%的 NaOH 溶液和 6ml碘甲烷，继续反应 60min。反应结束后，加入无水乙醇，出现白色沉淀，终止反应，透析三天，用冻干机将产品冻干，即得水溶性的季铵盐壳聚糖。 2.2 壳聚糖和季铵盐壳聚糖物的红外光谱表征 用 Nicolet-380型红外光谱仪进行分析。分别将 壳聚糖和季铵盐壳聚糖与溴化钾1:5 比例充分混合，压缩 5分钟成片。光谱分辨率 2cm-1，测量范围： 420-4000cm-1，扫描次数： 30次。 2.3 季铵盐壳聚糖的抑菌性能检
16、测 采用平板涂布法，以只含有菌液的 PBS 溶液为空白对照组，添加壳聚糖或季铵盐壳聚糖的菌液为实验组，观察作用相同时间后菌落的生长情况，检测季铵盐壳聚糖的抑菌性能 13。 2.3.1 培养基的配制及试剂的准备 准确称取一定量的营养琼脂放置到 500mL 的三角瓶中，加入适量的蒸馏水，配制成浓度为 3.3%（ w/v）的固体培养基，然后放置在磁力搅拌 器上搅拌溶解，搅拌速度为 300rpm。 用精密 pH试纸测量营养肉汤的 pH值。若 pH小于 7.6，则在搅拌状态下，向营养肉汤中逐滴加入 1moL/L NaOH 溶液，用 pH 试纸检测 pH 值，直至培养基 pH达 7.6。反之，则用 1mo
17、L/L HCL 溶液进行调节，同样调节至 pH达 7.6为止。待一种新型杀菌剂制备及性能研究 9 完全溶解后放入立式蒸汽灭菌锅中，于 121 C 下，高温灭菌 20min。灭菌后趁热倒入到培养皿中冷却，制备营养琼脂固体培养基。 准确称取 0.1g 壳聚糖，并置于紫外灭菌台灭菌备用。 准确称取 0.1g 季铵盐壳聚糖，并置于紫外灭菌台备用。 PBS 缓冲液的配制：准确称取 7.9g NaCl， 0.2g KCl， 0.24g KH2PO4(或者1.44g Na2HPO4)和 1.8g K2HPO4，溶于 800mL 无菌蒸馏水中，使其完全溶解。用精密 pH试纸测量溶液汤的 pH值。若 pH小于
18、7.4，则向 PBS溶液中逐滴加入 1moL/L NaOH 溶液 ，变加变搅拌，并经常用 pH试纸测定其 pH 值，直至培养基 pH达 7.4。反之，则用 1moL/L HCL 溶液进行调节，同样调节至 pH达 7.4 为止。最后加蒸馏水定容至 1 L，所得溶液即为 PBS 溶液（磷酸缓冲盐溶液），保存于 4 冰箱中即可。 2.3.2 菌株接种与培养 用接种针接种适量的金黄葡萄球菌，浸入装有 10mL无菌营养肉汤的试管中，快速震荡 2min，使接种针上的细胞脱离下来均匀进入液体培养基中，静置 20-30s，振荡培养 24h。培养后，用灭菌移液器移取 0.5mL菌液至装有 4.5mL 无菌应羊肉
19、汤的试管中，吹打 3次，让管内菌液混合均匀，即制得 10-1的菌悬液，然后重复上述步骤调整菌液浓度，使每毫升菌液稀释液中菌的数量为 106个。 取三个洁净的锥形瓶，分别向其中加入 9mL PBS 溶液，并将紫外灭菌后的壳聚糖和季铵盐壳聚糖分别加入到其 中两个锥形瓶中，使其充分溶解后，分别向三个锥形瓶中加入 1mL 菌液，摇床培养 12h。 培养后，用灭菌移液器移取 0.5mL 的菌液至装有 4.5mL 无菌 PBS 的试管中，吹打 3 次，让管内菌液混合均匀，即制得 10-1的菌悬液。再用灭菌移液器移取0.5mL 10-1菌悬液至装有 4.5mL 无菌 PBS的试管中，吹打 3 次，让管内菌液混合均匀，即制得 10-2的菌悬液。将 10-2的菌悬液涂布到灭菌冷却后的营养琼脂平板上。具体方法是：待培养基凝固后，用无菌吸管吸取 0.2mL 菌悬液对号接种在营养琼脂平板上（每组设两个重复）。再用无菌涂 布棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个平板用一个灭菌涂布棒，更换平板时需将涂布棒灼烧灭菌。将涂布好的平板放于桌上 20-30min，使菌液渗入培养基内，然后将平板倒转，置于恒温培养箱
