1、霍山石斛基源植物鉴定技术规程林业行业标准征求意见稿编制说明项目名称：霍山石斛基源植物鉴定技术规程项目编号：2015-LY-152委托单位：国家林业局科学技术司承担单位：皖西学院保证单位：安徽省林业厅起止年限：2015 年 1 月 - 2016 年 12 月上报日期：2018 年 10 月霍山石斛基源植物鉴定技术规程林业行业标准征求意见稿编制说明1 工作简况1.1 任务来源及协作单位本标准为国家林业局 2015 年下达编制任务，皖西学院为起草单位，金寨永惠康有机农业科技有限公司、九仙尊霍山石斛股份有限公司、霍山县天下泽雨生物科技发展有限公司、霍山县长冲中药材开发有限公司、金寨县茶业协会、山东博华
2、生态农业科技有限公司、海南胜嵘生物科技有限公司、安徽霍山县亿康中药材科技发展有限公司、金寨县金泽石斛种植专业合作社、安徽颂褀生物科技开发有限公司、霍山县市场监督检验所为参与起草单位。项目承担单位皖西学院拥有“安徽省石斛产业化开发协同创新中心”和” 植物细胞工程安徽省工程技术研究中心 ”两个省级研发平台，长期从事霍山石斛产业化研发工作，建有 500 万株的霍山石斛组培中心和30 余亩的霍山石斛栽培研究试验基地。参与起草单位中金寨永惠康有机农业科技有限公司、九仙尊霍山石斛股份有限公司、霍山县天下泽雨生物科技发展有限公司、霍山县长冲中药材开发有限公司、安徽霍山县亿康中药材科技发展有限公司、金寨县金泽
3、石斛种植专业合作社、安徽颂褀生物科技开发有限公司均从事霍山石斛栽培及枫斗加工企业，栽培面积已达 3000 余亩占整个霍山石斛栽培面积及枫斗加工量的三分之一以上；金寨县茶业协会和霍山县市场监督检验所主要参与枫斗市场管理及质量检测与监管。承担单位及协作单位在霍山石斛产业化开发方面的研究基础、生产规模及取得成果，为本标准起草奠定了坚实基础。1.2 主要工作过程本标准编制经历调研、研发和起草阶段，现已进入征求意见阶段。具体包括“收集资料调研生产企业及研发单位性状和分子鉴定研发完善结合项目承担单位的研究成果起草标准召开座谈会征求相关企业及专家意见修改已起草的标准草案形成标准征求意见稿”进一步征求相关企业
4、及专家意见，其目的在此基础上修改形成标准征求意见稿。收集资料：主要包括已有霍山石斛发表的相关论文、专著、鉴定的成果、申请的专利、霍山石斛地方标准等相关文献资料，为标准起草提供参考和借鉴。调研相关企业：调研从事霍山石斛种植生产与加工企业，包括调研参与标准起草的相关企业。重点调研了九仙尊霍山石斛股份有限公司、霍山县天下泽雨生物科技发展有限公司、霍山县长冲中药材开发有限公司、安徽霍山县亿康中药材科技发展有限公司、金寨县金泽石斛种植专业合作社、安徽颂褀生物科技开发有限公司、安徽省斛生记生物科技有限公司、安正元中药材科技有限公司等企业；调研了安徽省林业高科技中心。省外调研了从事石斛生产的山东博华生态农业
5、科技有限公司。召开征求意见会。2016 年 10 月 29 日，由安徽省林业厅科技处和安徽省林业标准化委员会在皖西学院组织召开了标准征求意见会。安徽省林业厅科技处处长主持会议，相关领导、专家，六安市质量技术监督局、霍山县市场监管局霍山县中药材产业发展局、霍山县石斛产业协会以及相关企业负责人应邀参加会议。通过不同方式征求意见，不断充实完善标准起草，形成标准征求意见稿。1.3 主要起草人及其承担工作皖西学院：韩邦兴、陈乃富、赵群、宋向文、陈乃东、陈存武、姚厚军、戴军。金寨永惠康有机农业科技有限公司：张质彬。九仙尊霍山石斛股份有限公司：戴亚峰。霍山县天下泽雨生物科技发展有限公司：张军。霍山县长冲中药
6、材开发有限公司：何祥林。金寨县茶业协会：戴任。山东博华生态农业科技有限公司：陈晋銮、翟红莲、苏亚平、赵红霞、高保军。海南胜嵘生物科技有限公司：王炳星、 宫汝路 安徽霍山县亿康中药材科技发展有限公司：李俊、李义鹏。金寨县金泽石斛种植专业合作社：张家泽。安徽颂褀生物科技开发有限公司：储蓄陈乃富、陈乃东、戴亚峰、张军、张质彬、陈晋銮、陈存武、王炳星、姚厚军、戴军、宫汝路、何祥林、翟红莲、李俊、李义鹏、张家泽、苏亚平、储蓄、赵红霞、姚皖湘。主要起草人承担的工作：韩邦兴：项目负责人，全面负责本标准起草并参与标准起草全过程；赵群、戴任、宋向文、陈乃东、张质彬、姚厚军、张军、戴军、何祥林、李俊、李义鹏、张家
7、泽、储蓄、陈晋銮、王炳星、赵红霞：主要是收集、整理资料，并负责本标准的初稿起草；陈存武、陈乃富、翟红莲、姚皖湘：主要负责本标准的文本格式把关及附录部分起草。同时陈乃东、戴任、戴军、戴亚峰参与附录部分起草。宫汝路、苏亚平：重点是参与检测方法起草及检测方法验证。起草小组通力合作，反复研讨论证、修改，完成了征求意见稿的起草工作。2 标准的编制原则和标准的主要内容2.1 编制原则本标准编制遵循：“科学、规范、适用”的原则，考虑标准的前瞻性、指导性，又要顾及生产实际，兼顾霍山石斛的产量和质量，具有适用性，可以作为政府相关部门监督、指导生产的依据，在生产上切实可行。确保霍山石斛的生产朝着健康的方向发展。本
8、标准按照国家标准管理办法 、 林业行业标准管理办法和 GB/T1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构与编写等规定要求编制，并根据项目单位前期研究基础及成果资料编写，符合国家产业可持续发展的相关规定。2.2 主要内容本标准主要内容包括霍山石斛“性状鉴定”和“分子鉴定”两方面内容。本标准规定了霍山石斛（Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng）基源植物鉴定的技术，包括性状、分子鉴定技术。本标准适用于霍山石斛基源植物的鉴定。2.2.1 霍山石斛性状鉴定主要内容2.2.1.1 茎45 条丛生，肉质，从基部上方向上逐渐变细，不分枝
9、，具节，淡黄绿色，有时带淡紫红色斑点，干后淡黄色。2.2.1.2 叶45 片，薄革质，长圆状披针形至披针形，斜出，基部具抱茎的鞘；叶鞘膜质，宿存。2.2.1.3 花（1）花序野生霍山石斛单花，顶生，直立；栽培霍山石斛总状花序 13 个，从落叶的老茎上部发出，具 12 朵花；花苞片浅白色带栗色。（2）花色淡黄绿色，肉质，有香气。（3）花萼中萼片卵状披针形；侧萼片镰状披针形，基部歪斜；萼囊近矩形，末端草绿色近圆形。（4）花瓣卵状长圆形；唇瓣近菱形，长和宽约相等，基部楔形并且具 1 个胼胝体，上部稍 3 裂，两侧裂片之间密生短毛，近基部处密生长白毛；中裂片半圆状三角形，基部密生长白毛并且具 1 个黄
10、色横椭圆形的斑块。（5）蕊柱淡绿色；蕊柱足基部黄色，密生长白毛。（6）药帽绿白色，近半球形，顶端微凹，前缘有流苏状裂，表面有毛状突起。（7）子房连花柱长 1.5cm 左右，黄绿色。2.2.1.4 果实蒴果黄绿色。2.2.1.5 种子种子白色，细小。2.2.2 霍山石斛分子鉴定主要内容2.2.2.1 仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录 A。2.2.2.2 溶液配制溶液配制方法见附录 B。2.2.2.3 引物通用引物 TY2s：5- CGCCATATTGATTGACACG -3通用引物 TY2a：5- GGCAGCCAACGAGAAGA -3特异性引物 CP2s：5- TTCGTGGGATGGGG
11、TTC -3特异性引物 CP2a：5- TGCACATCCGAGCCTGA -3特异性引物 HuoS：5- AAAAGGGATAGGTGC -3特异性引物 HuoA：5- GATTTGGGTTGTGATT -3以上所有引物均来自于专利 201610846153.7（见附录 C） 。2.2.2.4 操作程序（1）样品准备随机抽取 5 至 10 个个体分别取样。对于干燥样品，取 50 mg；对于新鲜样品，取 100 mg。（2）DNA 提取用 CTAB 法提取总 DNA。具体过程详见附录 D。（3）PCR 扩增反应体系反应体系总体积为 25 L，反应组分配制如下。DNA 模板 0.5 L（5- 5
12、0ng） ，上游引物 1 L（10 pmol） ，下游引物 1 L（10 pmol） ，10PCR Buffer 2.5 L，MgCl2（25 mM）1.5 L，dNTPs（10 mM）0.5 L， Taq DNA 聚合酶（5U/L） 0.5 L，ddH2O 补足至 25 L。反应程序反应程序可根据引物不同选下列程序中的一种。程序 1：95 5 min、35 个循环（每个循环包括 95 30 s，55 30 s，72 30 s） 、72 10 min。该程序来自于专利 201610846153.7（见附录 C） 。程序 2：95 5 min、45 个循环（每个循环包括 95 30 s，60 3
13、0 s，72 30 s） 、 72 10 min。该程序来自于专利 201610846153.7（见附录 C） 。程序 3：95 5 min、35 个循环（每个循环包括 95 30 s，46 30 s，72 30 s） 、72 10 min。注：通用引物 TY2s 和 TY2s 用程序 1，特异性引物 CP2s 和 CP2a 用程序 2，特异性引物 HuoS 和 HuoA 用程序 3。（4）DNA 质量检测反应程序 1 结束后，分别取 5 L 扩增反应产物，经琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析仪中观察并拍照。实验中设置无模板 DNA 的空白对照、阴性对照和阳性对照。实验重复 3 次。（5）P
14、CR 产物检测反应程序 2 结束后，分别取 5 L 扩增反应产物，经琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析仪中观察并拍照。实验中设置无模板 DNA 的空白对照、阴性对照和阳性对照。实验重复 3 次。（6）测序检测对反应程序 3 的扩增产物进行测序（送到测序公司进行测序） ，每个样本重复测序 3 次。2.2.2.5 数据采集（1）DNA 质量检测数据采集能扩增出 DNA 条带的数据记录为 1；不能扩增出 DNA 条带的数据记录为 0。（2）PCR 产物检测能扩增出 DNA 条带的数据记录为 1；不能扩增出 DNA 条带的数据记录为 0。（3）测序检测特异性引物 HuoS 和 HuoA 的 PCR
15、产物经测序后，长度为 171bp，并在其 53方向第 56 位为 G（和标准物种的特异性序列相同）的数据记录为 1；第 56位不为 G 的数据记录为 0。2.2.2.6 判定标准（1）DNA 质量检测如果数据记录为 1，判定为该样品的 DNA 质量合格，能用于后续实验；如果数据记录为 0，判定为该样品的 DNA 质量不合格，不能用于后续实验。以上检测根据专利 201610846153.7（见附录 C） 。（2）PCR 产物检测如果数据记录为 1，则所述待测样品中含有霍山石斛或细茎石斛，需要对样品进行测序检测；如果数据记录为 0，则所述待测样品中不含有霍山石斛。以上检测根据专利 20161084
16、6153.7（见附录 C） 。（3）测序检测如果数据记录为 1，则所述待测样品中含有霍山石斛；如果数据记录为 0，则所述待测样品中不含霍山石斛。3 主要技术指标、参数、试验验证的论述本标准的主要技术参数是“鉴定技术” 。主要包括：3.1 引物通用引物 TY2s：5- CGCCATATTGATTGACACG -3通用引物 TY2a：5- GGCAGCCAACGAGAAGA -3特异性引物 CP2s：5- TTCGTGGGATGGGGTTC -3特异性引物 CP2a：5- TGCACATCCGAGCCTGA -3特异性引物 HuoS：5- AAAAGGGATAGGTGC -3特异性引物 HuoA：
17、5- GATTTGGGTTGTGATT -33.2 PCR 反应程序程序 1：95 5 min、35 个循环（每个循环包括 95 30 s，55 30 s，72 30 s） 、72 10 min。该程序来自于专利 201610846153.7（见附录 C） 。程序 2：95 5 min、45 个循环（每个循环包括 95 30 s，60 30 s，72 30 s） 、 72 10 min。该程序来自于专利 201610846153.7（见附录 C） 。程序 3：95 5 min、35 个循环（每个循环包括 95 30 s，46 30 s，72 30 s） 、72 10 min。注：通用引物 TY
18、2s 和 TY2s 用程序 1，特异性引物 CP2s 和 CP2a 用程序 2，特异性引物 HuoS 和 HuoA 用程序 3。3.3 判定标准（1）DNA 质量检测如果数据记录为 1，判定为该样品的 DNA 质量合格，能用于后续实验；如果数据记录为 0，判定为该样品的 DNA 质量不合格，不能用于后续实验。（2）PCR 产物检测如果数据记录为 1，则所述待测样品中含有霍山石斛或细茎石斛，需要对样品进行测序检测；如果数据记录为 0，则所述待测样品中不含有霍山石斛。（3）测序检测如果数据记录为 1，则所述待测样品中含有霍山石斛；如果数据记录为 0，则所述待测样品中不含霍山石斛。本标准是长期研究和
19、实践基础上提出的，科学、适用、实用、简单、可靠。4 本标准编写未采用国际和国外先进标准因为霍山石斛仅为我国特有种，国外无此石斛种。5 本标准符合有关现行法律法规以及强制性国家标准、行业标准的要求。6、重大分岐意见的处理经过和依据在起草及研讨和会议征求意见过程中没有发生重大分岐意见。7 本标准作为推荐性标准。8 贯彻标准的措施、建议本标准作为推荐性标准，应加强标准的宣讲解读，引导霍山石斛生产企业和种植户自觉按照这一标准进行霍山石斛基源植物的鉴定，保证种源的纯正性。可以组织专门的培训班进行标准贯彻培训，尤其是宣传标准的重要意义和培训鉴定的基本方法，同时建立标准化示范点、示范区，通过示范加快标准的贯彻，保证霍山石斛的品质。霍山石斛基源植物鉴定技术规程编写小组2018 年 10 月
