1、1原位杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称 RNA 原位杂交组织化学(RNA in situ hybridization histochemistry)或 RNA 原位杂交6,7,25 (RNA in situ hybridization RISH).该技术是指运用 cRNA 或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内 RNA 表达的一种原位杂交技术.其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的 RNA 核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交),所形成的杂交体(Hybrids) 经显色反应后
2、在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA,rRNA 和 tRNA 分子.RNA 原位杂交技术经不断改进,其应用的领域已远超出 DNA原位杂交技术.尤其在基因分析和诊断方面能作定性,定位和定量分析,已成为最有效的分子病理学技术,同时在分析低丰度和罕见的 mRNA 表达方面已展示了分子生物学的一重要方向.RNA 原位杂交不同于 DNA 原位杂交主要有 :(1)使用的探针不同:RNA 原位杂交中多采用 RNA 或寡核苷酸探针,因此避免了应用双链 DNA 探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题.cRNA-RNA 之间形成的杂交体要比 DNA-DNA,cDNA-RN
3、A 杂交体性能稳定,在杂交反应后可用 RNA 酶洗脱,以除去未结合的探针,因此特异性更强.(2)检测的目的不同:RNA 原位杂交检测和分析的主要为内源性基因,包括细胞内固有基因,异常基因和变异基因.以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态,探索疾病发病机理,观察治疗的疗效和评估疾病的预后等.其次为对外源性基因检测,以获得病毒和细菌类型等病原学诊断.而 DNA 原位杂交主要为外源性基因检测.(3)有较高的灵敏度:在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时,RNA 原位杂交能获得较好定位,而DNA 原位杂交则难以信任.但 RNA 原位杂交也存在某些不足之处 ,为使 RNA 原位杂交标准化和克服其不
4、足之处必须注意以下几点:(1)不同探针种类的选择,制备和标记要适合靶核酸和组织的特点;(2) 有效制止组织和细胞内 RNA 降解;(3)实验流程中严防 RNA 酶污染;(4)对杂交信号有效的放大和显色技巧;(5)阳性结果判别,不仅需要有阳性和阴性标本对照,有条件的更需要观测 Northern 杂交和免疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中,基因2及其产物两者表达之间联系.(6)在实验流程的各个技术环节中熟练运用技术控制是保证RNA 原位杂交成功的必要条件.近几年来 RNA 原位杂交已得到稳步发展.主要表现在:非同位素标记的探针制备和标记技术的进步,杂交信号放大的应用,组织预处理的改进,RNA原
5、位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦显微镜在多重 RNA 原位杂交中应用等.从理论上讲,RNA 原位杂交已趋成熟和完善,关键是在实际应用中能否被人们所受接并应用到各学科的研究中,促进人们对各类基因识别和表达规律的认识. 原位杂交操作方法 1（一） 、仪器设备 医用微波炉； 水浴锅。（二） 、试剂 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容 0.5L。0.1mol/L 三乙醇胺(pH8.0): 三乙醇胺 5.33ml，H20 定容 0.4L。.5ml/L 醋酸-2.5ml/L 醋酸酐 :三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容 0.98L，醋酸酐
6、 （用前加） 2.5ml。20SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠 88.2g，H20 定容 1L。100Denhardts ：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容 50ml。杂交液：Formamide 5ml，20SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100Denhardts 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。Buffer （pH7.5）：0.1mol/L risCl，0.15mol/L NaCl。Buffer（pH9.5）：0.1mol/L TrisCl，0.1m
7、ol/L NaCl， 0.05mol/L MgCl2。Buffer（pH8.0）：10mmol/L TrisCl，1mmol/L EDTA。 （三） 、操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的 RNA 原位杂交第一天1） 二甲苯于 37脱蜡 2 次，每次 15 分钟；2） 无水乙醇浸泡 2 次，每次 3 分钟；33） 95%乙醇浸泡 2 次，每次 3 分钟；4） PBS 清洗 3 分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡 10 分钟；6） PBS 清洗 10 分钟；7） 加入胃蛋白酶 25ul/ml，37孵育 15 分钟；8） PBS 清洗 2 次，每次 3 分钟；9） 0.2N 的
8、 HCl 孵育 30 分钟；10）PBS 清洗 2 次，每次 3 分钟；11）0.25%无水乙酸和 0.1M 三乙醇胺孵育 10 分钟；12）PBS 清洗 2 次，每次 5 分钟；13）预杂交缓冲液孵育 30 分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85加热 5 分钟，置于冰块中10 分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于 SSC 中 2 次，每次 5 分钟以去除封片；17）PBS 清洗 3 分钟；18）RNA 酶 A 溶液中（或 0.1-1ng/mlPBS 中） ，37孵育 30 分钟；19）PBS 清洗 5 分钟；20）室温，2SSC 清洗 10 分钟；21）37，1S
9、SC 清洗 10 分钟；22）37，0.5SSC 清洗 10 分钟；23）缓冲液 A 孵育 10 分钟；24）缓冲液 A（1%正常绵羊血清和 0.03%三重氢核 X-100）孵育 30 分钟；25）加入抗地高辛抗体（1/200 的上述缓冲液，来自 Boehringer Mannheim） ，37孵育 3 4小时；26）缓冲液 A 清洗 2 次，每次 10 分钟；27）缓冲液 B 清洗 2 次，每次 5 分钟；28）制成 NBT/BCIP 暗处保存 30-60 分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到 16 小时；29）停止缓冲液 B 的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以
10、及封片进行核的复染。2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位 DNA 杂交第一天1） 二甲苯于 37脱蜡 2 次，每次 15 分钟；2） 无水乙醇浸泡 2 次，每次 5 分钟；3） 95%乙醇浸泡 2 次，每次 5 分钟；4） PBS 清洗 5 分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡 10 分钟；6） PBS 清洗 5 分钟；7） 加入胃蛋白酶 25ul/ml，37孵育 10 分钟；8） PBS 清洗 2 次，每次 5 分钟；9） 0.2N 的 HCl 孵育 30 分钟；10）PBS 清洗 2 次，每次 5 分钟；11）0.25%无水乙酸和 0.1M 三乙醇胺孵育 10 分钟；12）
11、PBS 清洗 5 分钟；13）预杂交缓冲液孵育 30 分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针； 15）杂交；第二天16）将玻片置于 SSC 中以去除封片；517）室温，2SSC 清洗 10 分钟；18）37，1SSC 清洗 10 分钟；19）37，0.5SSC 清洗 10 分钟；20）缓冲液 A 孵育 10 分钟；21）缓冲液 A 孵育 30 分钟；22）加入抗地高辛抗体 37孵育 3 小时；23）缓冲液 A 清洗 2 次，每次 5 分钟；24）缓冲液 B 清洗 2 次，每次 5 分钟；25）制成 NBT/BCIP 暗处保存 30-60 分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚
12、佳，显色时间可长到 16 小时；26）停止缓冲液 B 的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为 in situ hybridization,其中 in situ 为拉丁文，原义是“in its natural position“. 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的 DNA 或者 RNA 只要他们的序列是互补的，即符合 AT，CG 的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，D
13、NA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的 mRNA 在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。该技术最早应用于 60 年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内 RNA 进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内 DNA 或 RNA 研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序6列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细
14、胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为 DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA 杂交。但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重
15、要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。原位杂交（In situ hybridazation）固定收集斑马鱼的胚胎，在 Holfretor 水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用 4%多聚甲醛固定，在 4保存，二十四小时后用 50%甲醇 2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成)一. 原位杂交第一天1.
16、重新水化和固定1） 吸取固定好的胚胎，加入 50%甲醇的 PBST 溶液，放置 5 分钟。2） 置换成 30甲醇的 PBST 溶液，放置 5 分钟73） 置换成 PBST 溶液，放置 5 分钟，重复一次4） 置换成 4多聚甲醛的 PBS 溶液固定 20 分钟5） 用 PBST 洗两次，每次放置五分钟，室温。蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）1） 用 10ul/ml 的蛋白酶 K 在室温下处理胚胎。5 体节以下的胚胎不处理，5 体节到 24小时的胚胎处理 3 分钟，24 小时以上的胚胎处理 5 分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏
17、松组织，以便于杂交。2） 用 PBST 溶液轻洗，在 PBST 中放置 5 分钟。3） 用 4多聚甲醛的 PBS 溶液固定 20 分钟，室温。4） 用 PBST 洗两次，每次放置五分钟，室温。2. 预杂交1）每个管中置换成大约 300ulHYB溶液，60水浴 5 分钟，避免振荡。2）用等体积的 HYB取代 HYB。3）60水浴，预杂交 4 小时以上。3. 杂交1）吸去预杂交的 HYB，加上 100ul 已加入探针的 HYB溶液（探针浓度约为1ng/ul）.2）60 温浴过夜。注：杂交与预杂交的温度可以是 55 到 60 度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。二. 原位杂交第二天8
18、1. 1）将探针回收，放于20C 保存(通常探针可重复使用十次左右)。2）加入 50%甲酰胺/2XSSCT 溶液 1 毫升，60 ，放置 30 分钟，重复一次。3）置换 2XSSCT1ml，60，放置 15 分钟。4）置换 0.2XSSCT1ml，60，放置 30 分钟，重复一次。2. 1）用 MABT 洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。2）室温下加 1ml 1：2：7 溶液，时间为一小时。3）按 1：3000 的比例在 1：2：7 溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。三. 原位杂交第三天1） 用 1ml 含 10热灭活血清的 MABT 溶液置换抗体溶液，放置摇床上 25 分钟，然后
19、用 1mlMABT 置换，25 分钟，再用 1mlMABT 溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT 溶液置换，25 分钟。2） 用 1ml 1mM 左旋米睉的 Staining buffer 洗三次，每次放置五分钟。3）将胚胎转入十六孔板中，吸去 staining buffer，加上 300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加 5mM 左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用 PBST 洗两三次后加上 4多聚甲醛固定，拍照。6）4C 冰箱保存。原位杂交中溶液的配制：P
20、BS:NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44g9KH2PO4 0.24gDEPC H2O 1LHCl 调 PH 值至 7.4抽滤，灭菌4% 多聚甲醛：多聚甲醛 40gPBS 1L加热持续搅拌至溶液澄清。-20保存PBST：PBS 溶液加上 Tween-20 使其终浓度为 0.1%。20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2gNaCl 175.5gDEPC H2O 至 1L抽滤，灭菌SSCT：SSC 加上 Tween-20 使其终浓度为 0.1%。HYB-：甲酰胺：20XSSC 储液：DEPC 水=2：1：1 配制加入 Tween-20 使其终浓度为 0.1%，-20
21、c 保存。HYB+：HYB- 20mlyeast RNA 10mgheparin 1mg。-20保存。10MAB：maleic acid 11.6gNaCl 8.8g用固体 NaOH（约 7g）调至 Ph=7.54保存MABTMAB 加上 Tween-20 使其终浓度为 0.1%.10% blocking reagent:blocking reagent 8gMAB 72ml1：2：7 溶液：灭活羊血清：10% BM blocking reagent：MABT=1：2：7用时现配Staining buffer：Tris 12.1gpH9.5Mgcl 6H2O 10.2g,Nacl 5.85gTween-20 1ml,用之前加 1M 的左旋咪唑储液，使之终浓度为 1mM我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。
