实验六大肠杆菌感受态细胞的制备和转化基因工程的基本路线PCR质粒DNA提取和酶切连接转化操 作 步 骤（一） 受体菌的培养 1、70或20低温冰箱取出菌种后，在LB培养液中培养过夜，进行活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。） （二）、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将1.5ml菌液移入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4下5000rpm离心5分钟。2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余的过多水分）。3、加入1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液，轻轻拨动管底使细胞完全悬浮,冰上放置15分钟后,4下5000rpm离心5分钟。 3、弃去上
