1、止血镇痛散的制备及质量标准研究邱建国，张泉龙，尉丽力，李茂星，贾正平 ，张汝学，周珺，邱宜农（兰州军区兰州总医院药材科，全军高原环境损伤防治重点实验室，甘肃，兰州，730050）摘要：目的：制备止血镇痛散并建立其质量控制方法。方法：独一味水提物经聚酰胺去除总黄酮，大孔树脂富集得到总环烯醚萜苷，并以环烯醚萜苷为原料制备独一味止血镇痛散。以 8-O-乙酰山栀子苷甲酯为对照品进行薄层色谱定性鉴别；含量测定采用一阶导数紫外分光光度法测定总环烯醚萜苷；HPLC 法测定山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯。 结果：TLC 法可以较好地鉴别 8-O-乙酰山栀子苷甲酯，阴性对照显示无干扰；建立的一阶导数紫
2、外分光光度法测定总环烯醚萜苷的含量，总环烯醚萜苷平均加样回收率为 104.40 %，RSD%=0.64 %；建立的 HPLC 法测定山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯的含量，平均加样回收率分别为 94.74 %和 100.59 %，RSD 分别为 2.27 %和 1.61 %。结论：提取工艺可行，可进行工业化生产制备；质控方法准确、可靠，可有效评价止血镇痛散的质量。关键词：独一味环烯醚萜苷；止血镇痛散；制备；质量标准中图分类号：R283161 ;R92711 文献标识码 A -Preparation and Quality Criteria of Zhi Xue Zhen Tong Po
3、wderQiu Jian-guo, Zhang Quan-long, Wei Li-li, Li Mao-xing, Jia Zheng-ping , Zhang Ru-xue, Zhou Jun, Qiu Yi-nong（Department of Pharmacy， Lanzhou General Hospital of PLA; Key laboratory of the prevention and cure for the plateau environment damage,PLA,Lanzhou,Gansu,730050）OBJECTIVE: To preparation Zhi
4、 Xue Zhen Tong Powder, and establish its quality standard to control its therapeutic efficacy. METHODS: Zhi Xue Zhen Tong Powder was composed with the iridoid glycosides ingredients, which was enriched by the macroporous adsorptive resins chromatographic column combining with polyamide chromatograph
5、ic column and pre-column to eliminate flavonoids from the aqueous extract of Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo(LRAE). Lamiophlomis rotata was identified by TLC and the content of total 收稿日期 基金项目 甘肃省科技重大专项（1102FKDA012） ；全军中医药研发推广项目（2006032001）第一作者 邱建国，副主任药师，主要从事高原植物药和新药的研究。Tel：09318994676，13609354193
6、；E-mail： 通讯作者 贾正平，主任药师，教授，博士生导师，主要从事医院药学专业的研究。Tel：09318994652；E-mail： Comment LU1: 何课题组 ？iridoid glycosides was determined by the first derivative spectrophotometry, the content of shanzhiside methylester and 8-O- acetylshanzhiside methylester was determined by HPLC. RESULTS: the TLC spots of shanzh
7、iside methylester and 8-O- acetylshanzhiside methylester were all clear. The total iridoid glycosides determination for the preparation was established, and the average recovery of the methods was 104.40%, RSD was 0.64%. A HPLC method for the determination of shanzhiside methylester and 8-O- acetyls
8、hanzhiside methylester in the preparation was established. The average recoveries were 94.74% and 100.59%, RSD were 2.27% and 1.61%, respectivly. CONCLUTION: the methods are accurate and reliable, and can control the quality of the preparation effectively.Key Words: Lamiophlomis rotata (Benth.) Kudo
9、 iridoid glycosides; Zhixuezhentong powder; prepared; quality criteria独一味是藏、蒙、纳西等民族的民间草药，为唇形科植物 Lamiophlomis rotata (Benth) Kudo的根及全草。具有活血止痛、化瘀止血、增强免疫力等功效，临床用于刀口疼痛、出血、外伤骨折、筋骨扭伤、风湿痹痛以及崩漏、痛经、牙龈肿痛、出血，疗效显著 1,2。近年来，本课题组对独一味成分、药效、毒理及其制剂进行了系统的研究，通过药理实验筛选，首次确定了独一味总环烯醚萜苷是独一味的止血、镇痛活性部位，并应用现代天然药物化学分离方法，创造性地采用大
10、孔吸附树脂结合聚酰胺柱分离、纯化、富集独一味中总黄酮、总环烯醚萜苷及大极性成分，相关工艺流程获得国家发明专利（ZL200410011679.0） 3；并参与了中国药典2010 版一部中独一味药材及制剂含量测定项的修订。本课题组以总环烯醚萜苷为主要成分，开发了具有止血镇痛作用的外用制剂独一味止血镇痛散，并制定了质量标准，实现了藏药独一味二次开发。1.仪器与试药高效液相色谱仪（美国 Waters公司） ，包括 600型二元梯度泵、996 型二极管阵列紫外检测器；HP 8453二级管阵列紫外可见分光光度计（美国惠普公司） ；BP210S 电子天平（Sartorius AG，德国） ；Transfor
11、mer B-5紫外线检出器（SHIMADZU ，日本） ；SK7200H超声波清洗器（上海科导仪器有限公司） ；柱层析用聚酰胺（1430 目） （上海化学试剂站分装厂，960711） ；大孔树脂（XDA-1，西安蓝晓科技有限公司） ；硅胶 G板（青岛市基亿达硅胶试剂厂，100100，20030703）等。8-O-乙酰山栀子苷甲酯 对照品、山栀子苷甲酯对照品 (由本研究室分离纯化并鉴定Comment LU2: 除权威单位提供外，应有纯度报告和图谱。Comment LU3: 拉丁文？药用部位？Comment LU4: 1030目 结构，HPLC 归一化法测定 含量纯度分别为 97.5、98.5%，
12、见图 3中对照品 HPLC图谱)；磷钼酸（北京化工厂） ；无水甲醇，三氯甲烷均为分析纯；水为纯化水，乙腈为色谱纯；独一味药材（Lamiophlomis rotata (Benth) Kudo的根及全草） （购自甘肃省玛曲县黄河首曲药源开发有限公司，2010 年产） ，经兰州军区兰州总医院药材科李茂星博士鉴定，与中国药典2010 版一部正品相符，独一味水提物（购自甘肃省玛曲县黄河首曲药源开发有限公司，批号：20090901，20090902，20090903）2.方法与结果2.1 止血镇痛散的制备 2.1.1 总环烯醚萜苷的提取 4：分别称取三批独一味水提物，20 kg，溶于 200 L水中，上
13、聚酰胺柱（1030 目，40 kg）去除总黄酮，流出液上 XDA-1大孔吸附树脂柱（100 kg） ，用水冲洗至无色，用 70 %乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，富集总环烯醚萜苷，回收乙醇洗脱液，60减压干燥，得独一味总环烯醚萜苷成分，超微粉碎。2.1.2止血镇痛散工艺优选：称取独一味总环烯醚萜苷超微细粉适量，3 份，分别内加微粉硅胶 0.3 %，外加微粉硅胶 0.3 %、外加滑石粉 0.3 %，混匀，考察休止角、临界相对湿度，结果见表 1。表 1 止血镇痛散处方优选试验结果Table 1 Optimizing results for prescription of Zhi Xue Zhen Tong
14、 powder处方号独一味环烯醚萜苷细粉用量（g）辅料及用量（g）临界相对湿度（%） 休止角 装量差异 外观性状1 10 外加微粉硅 胶 0.0316 68 % 43.6。 3% 蓬松、流动性好2 10 内加微粉硅 胶 0.0107 68 % 45.9。 6% 比细粉略有改善3 10 外加滑石粉 0.0308 72 % 45.5。 5.6% 比细粉略有改善注：辅料均过 80目筛2.1.3止血镇痛散的制备：根据优选的工艺，称取独一味总环烯醚萜苷超微细粉适量，外加微粉硅胶 0.3 %，混匀，分装，即得。 （批号 100101、100202、100303） 。2.2 止血镇痛散质量标准的制定：2.2
15、.1 薄层色谱鉴别实验2.2.1.1 供试品溶液制备 称取 3 批独一味水提物及止血镇痛散粉末各 1 g，加乙醇 10 mL，加热回流 15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。2.2.1.2 药材溶液和对照品溶液的制备 取独一味药材适量，粉碎，称取 1 g，加乙醇 10 mL， 加热回流 15 min，滤过，滤液作为药材溶液。另取山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯对照品各 0.01 g，加乙醇 10 mL，得混合溶液，作为对照品溶液。2.2.1.3 薄层色谱鉴别 照薄层色谱法 1试验，吸取上述溶液各 10 l，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（4：1）为展开剂，展开，取出，
16、晾干，喷以磷钼酸溶液，在 105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，分别在与药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图 1。a-c:三批独一味水提物；d-f: 三批止血镇痛散；g. 对照药材；h. 对照品溶液图 1 独一味水提物及其制剂薄层层析结果图Figure.1 TLC chromatogram of L. rotataa-c Aqueous extract:; d-f: Zhi Xue Zhen Tong Powder; g.Control LR; h. Standerd shanzhiside methylester and 8-O- acetylshanzhiside m
17、ethylester2.3 检查2.3.1 水分测定按中国药典2010 版一部附录 IX H 水分测定法，三批样品水分检查结果符合药典a b c d e f g h规定，未超过 9 %。结果见表 2。表 2 水分检查结果表Table 2 Moisture content results of Zhi Xue Zhen Tong powder批 号 100101 100202 100303水 分（% ） 5.44 2.71 2.632.3.2 装量差异依据中国药典2010 年版一部附录 I C 通则，进行检查，三批样品装量差异均符合药典规定。2.3.3 微生物限度 按中国药典2010 版一部附录
18、 X C 微生物限度检查法，三批样品微生物限度检查结果符合药典规定。2.3.4 重金属 按中国药典2010 版一部附录 E 重金属检查法中的第一法检查。三批中试样品重金属限度检查结果符合药典规定，均未超过百万分之十。2.3.5 砷盐 按中国药典2010 版一部附录 F 砷盐检查法进行，三批中试样品砷盐限度检查结果符合药典规定，均未超过百万分之二，结果见图 2。空白 标准砷斑 批号 100101 批号 100202 批号 100203图 2 三批止血镇痛散砷盐检测结果图Figure.2 Arsenic salt detection result of Zhi Xue Zhen Tong powd
19、er2.4 含量测定2.4.1 一阶导数紫外分光光度法测定总环烯醚萜苷含量 52.4.1.1 对照品溶液的制备 精密称定从独一味中分离得到的 8-O-乙酰山栀子苷甲酯对照品21.6 mg，于 100 mL 量瓶中，纯化水定容，得对照品溶液（216.0 g.mL -1） 。2.4.1.2 供试品溶液的制备 分别称取独一味水提物和止血镇痛散 0.010 g，精密称定，置100 mL 容量瓶中，纯化水定容，得供试品溶液。2.4.1.3 标准曲线的制备 取对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别置 6个 10 mL 量瓶中，加蒸馏水定容，采用一阶导数于 252 n
20、m 测定吸光度。回归方程为：A= -0.001C+ 0.0002 （r= 0.9995 ） ，对照品在 10.875.6g.mL-1 范围内线性关系良好。2.4.1.4 供试品的含量测定 在 252 nm 测定一阶导数吸光度，由回归方程求供试品溶液的浓度，再计算供试品中总环烯醚萜苷的含量，结果见表 1。表 1 止血镇痛散和水提物中总环烯醚萜苷含量测定结果表Table 1 Contents of total iridoid glycosides in Powder and aqueous extract.批号 供试品含量 (%)供试品平均含量 (%)水提物 090101 16.55水提物 090
21、202 15.16水提物 090303 16.7316.15止血镇痛散 100101 54.16止血镇痛散 100202 58.30止血镇痛散 100303 57.9556.802.4.2 高效液相色谱法测定 8-O-乙酰山栀子苷甲酯和山栀子苷甲酯含量2.4.2.1 色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以 9 乙腈溶液为流动相 A，15 乙腈溶液为流动相 B，按表 2 中的规定进行梯度洗脱；检测波长为235 nm。理论板数按山栀苷甲酯峰计算应不低于 3000 。表 2 梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution for HPLC时间（min） 流速（mL
22、/min） 流动相 A（%） 流动相 B（%）1 100 07.00 1 100 011.00 1 0 10024.00 1 0 10028.00 1 100 031.00 1 100 02.4.2.2 对照品溶液的制备 分别称取山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯各 0.001 g，精密称定，用 70%甲醇溶液定容至 25mL，制得混合对照品溶液(山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯 40 g/mL)。2.4.2.3 供试品溶液制备方法的优选 分别称取独一味水提物 0.1 g，精密称定，称取 9 份，分 3 组，每组 3 份，分置具塞锥形瓶中，精密加入 70%甲醇 25 mL，密塞，
23、称定重量；第一组回流提取 1 h，第二组超声提取 30 min，第三组振摇提取 30 min，结束后，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，进样，测定。结果见表 3。表 3 供试品溶液制备方法优选Table 3 The consideration of extraction method山栀子苷甲酯 8-O-乙酰山栀子苷甲酯序号 提取方法 含量C(mg/g） 平均含量C(mg/g） RSD(%) 含量C(mg/g） 平均含量C(mg/g） RSD(%)1 回流 1 12.79 42.692 回流 2 15.21 50.043 回流 3 13.5713.79 12.6447.64
24、46.79 8.014 超声 1 13.87 45.495 超声 2 14.28 48.186 超声 3 13.9514.03 1.5350.5548.07 5.117 振摇 1 13.39 48.038 振摇 2 14.10 47.599 振摇 3 13.7513.75 2.5943.7246.45 5.27根据测定结果可知，超声提取的山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯的含量最高，提取误差最小，RSD 分别为 1.53 %和 5.11 %，因此，以超声提取制备供试品溶液。2.4.2.4 测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 l，注入液相色谱仪，按外标一点法计算。2.4.2.
25、5 精密度试验 精密吸取已知浓度的对照品溶液（山栀子苷甲酯 60 g/mL，8-O-乙酰山栀子苷甲酯 67.2 g/mL）10 l ，重复进样 6 次，山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯 RSD 分别为 1.01 %和 1.98 %。2.4.2.6 重复性试验 取同一供试品 6 份, 按供试品溶液制备项下，测定结果表明重复性良好，山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯 RSD 分别为 2.12 %和 3.48 %。2.4.2.7 稳定性试验 对照品溶液放置室温，在同 1 d 内每隔 2 h 测定，连续考察 8 h，稳定性好，山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯 RSD 分别为 1.
26、55 和 1.63 %。2.4.2.8 加样回收率试验 取同一浓度的供试品 6 份，精密加入一定量的已知浓度的被测成分对照品（供试品：对照品1：1 加入） ，依法测定。结果见表 4。山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯平均回收率分别为 94.74 和 100.59 %，RSD 分别为 2.27 和 1.61 %。表 4 加样回收率试验结果（n=6）Table 4 Results of recovery test (n=6)样品 供试品中的含 量（mg）加入对照品量（mg）测得量（mg）回收率（）平均回收率（） RSD(%)0.9965 1.0000 1.9436 94.710.9907 1
27、.0000 1.9432 95.260.9301 1.0000 1.8579 92.780.9770 1.0000 1.9124 93.541.0395 1.0000 2.0268 98.73山栀子苷甲酯0.9282 1.0000 1.8628 93.4694.74 2.271.2444 1.1200 2.3795 101.341.2371 1.1200 2.3538 99.701.1614 1.1200 2.2746 99.391.2200 1.1200 2.3374 99.761.2981 1.1200 2.4583 103.598-O-乙酰山栀子苷甲酯 1.1590 1.1200 2.2
28、761 99.74100.59 1.612.4.2.9 供试品含量测定 根据优选的提取方法制备独一味水提物和止血镇痛散供试品溶液，分别进样 10 L，测得峰面积，由外标一点法计算得供试品浓度，结果见图 2 和表5。1. 对照色谱图 2. 阴性对照色谱图 Comment LU5: n=? 3. 独一味止血镇痛散色谱图 4. 独一味水提物色谱图A. 山栀苷甲酯；B. 8-O- 乙酰氧基山栀苷甲酯图 3 对照品、止血镇痛散、水提物及空白干扰 HPLC色谱图Figure 3 HPLC Chromatograms of control、Zhi Xue Zhen Tong Powder、aqueous e
29、xtract and Negative control1.The shanzhiside methylester and 8-O- acetylshanzhiside control; 2. Negative control; 3. Zhixue Zhentong Powder; 4. Aqueous extractA. shanzhiside methylester; B. 8-O- acetylshanzhiside表 5止血镇痛散和水提物中山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯的含量测定表Table 5 The content of shanzhiside methylester an
30、d 8-O- acetylshanzhiside methylester in Zhixuezhentong Powder and aqueous extract.山栀子苷甲酯 8-O-乙酰山栀子苷甲酯供试品平均含量 C(mg/g） RSD（） 平均含量 C(mg/g） RSD（）止血镇痛散 100101 80.62 1.50 91.04 3.51止血镇痛散 100202 74.76 1.83 71.04 1.39止血镇痛散 100303 77.90 1.80 72.50 3.90水提物 090101 18.19 3.98 19.38 2.45水提物 090202 19.18 3.51 21.
31、39 3.42水提物 090303 19.13 2.68 20.46 3.253.讨论通过 TLC实验，用磷钼酸溶液显色，水提物及止血镇痛散中环烯醚萜苷类成分与对照药材和对照品在相同 Rf位置上显相同的蓝色斑点。对照药材与水提物在紫外灯下还出现黄色荧光斑点（成分为黄酮类化合物） ，而止血镇痛散中由于去除了黄酮类成分，因此没有出现荧光斑点。有关独一味含量测定，解军波等 6采用 LC-MS /MS 法测定木犀草素含量，桑育黎等7采用 HPLC法测定独一味软胶囊中 8-epideoxyloganic acid含量，何希瑞等 8采用 HPLC法测定独一味颗粒剂、胶囊剂、片剂等制剂中的山栀苷甲酯含量；本
32、课题组采用 HPLC法，梯度洗脱的方法同时测定了山栀苷甲酯和 8-O-乙酰山栀苷甲酯的含量，在含量测定研究中，对供试品溶液的制备方法也进行了筛选，通过对回流提取、超声提取和振荡提取三种方法进行对比，超声提取具有方法简单、无需高温，萃取效率高等特点，因此最终选取了超声提取供试品中的山栀子苷甲酯和 8-O-乙酰山栀子苷甲酯。一阶导数紫外分光光度法测定总环烯醚萜苷含量试验结果显示，总环烯醚萜苷含量由水提物中的 16.15%，提高到止血镇痛散 56.80 %；通过 HPLC测定，山栀子苷甲酯和8-O-乙酰山栀子苷甲酯的含量分别由水提物中的 18.83 mg/g 和 20.14 mg/g 提高到止血镇痛
33、散中的 77.76 mg/g 和 78.19 mg/g。通过止血镇痛散和水提物中含量比较，此方法可有效地富集总环烯醚萜苷成分，提高总环烯醚萜苷成分。所以，以独一味水提物为原料，经聚酰胺去除黄酮类成分，大孔树脂富集总环烯醚萜苷，减压干燥，超微粉碎制备的止血镇痛散，具有止血镇痛疗效强，使用剂量小，安全性高的特点。参考文献：1 国家药典委员会. 中国药典.一部. 北京:化学工业出版社 ,2005. 附录, H.2 国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草.第 7 卷. 上海科学技出版社,1999. 6074-6075.3 国家发明专利（ZL200410011679.0）:从藏药独一味中提取环烯醚萜
34、苷的方法及用途。4 邱建国，张泉龙，尉丽力，李茂星，等.工业化提取分离纯化独一味总环烯醚萜苷类成分J.中国实验方剂学杂志，2011，13（17）：32-365 李茂星,贾正平,胡之德,等. 藏药独一味中总环烯醚萜苷的含量测定J. 华西药学杂志, 2007,22:208-210.6 解军波，张彦青，吴国娇，等. LC-MS /MS 法测定独一味中木犀草素J. 中国实验方剂学杂志，2010，16（7）：64-667 桑育黎，郝延军，陈沉，等. HPLC 测定独一味软胶囊中 8-epideoxyloganic acid 的含量J. 中国实验方剂学杂志，2010，16（13）：107-1088 何希瑞，李茂星，樊鹏程，等. HPLC 法测定独一味制剂中山栀苷甲酯J.中国实验方剂学杂志，2010，16（7）：50-52
