1、 1 麦胚蛋白双酶酶解物 的制备及其 体外 醒酒活性的研究 罗思媛 1 郭红英 1,2* 张琳娜 1 王锋 1,2 谭兴和 1,2 何蕾 1 (1.湖南农业大学 食品科学与技术学院，湖南 长沙 410 128； 2. 食品科学与生物技术湖南省重点实验室 , 湖南 长沙 410 128) 摘 要 为充分利用麦胚资源，制备具有醒酒作用的麦胚肽，本文以 Na2CO3 预处理过的麦胚为原料，以肽得率（ TCA-PSI）、水解度（ DH）及乙醇脱氢酶（ ADH）激活率为指标，研究了碱性蛋白酶（ Alcalase）、中性蛋白酶（ Neutral）双酶分 步酶解工艺及酶解物的醒酒活性。结果表明，双酶分步酶解
2、的最优工艺条件为麦胚蛋白浓度为 3.5%， Alcalase 添加量 400 0 U/g， Neutral添加量 100 0 U/g，所得酶解物的 TCA-PSI、 DH、 ADH激活率分别为： 75.49%、 65.18%、 68.37%。表明麦胚蛋白双酶酶解物可以显著提高 ADH的活力，具有较好的体外醒酒活性。 关键词 麦胚蛋白 双酶酶解 肽得率 乙醇脱氢酶 醒酒活性 中图分类号： TS201.4 文献标识码： A 文章编号： 201 703 20 Preparation and in vitro Sobering Activity of Wheat Germ Protein Hydrol
3、ysates by Double Enzymes Luo Siyuan1 Guo Hongying1,2* Zhang Linna1 Wang Feng1,2 Tan Xinghe1,2 He Lei1 (1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410 128, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410 128, China） Abs
4、tract For effective utilization of wheat germ and prepare wheat germ peptides with facilitating alcohol metabolism, the doublly enzymatic hydrolysis of wheat germ pretreated by Na2CO3 was studied. Two proteases, alcalase and neutral, were used step by step. The activation rate ofTCA-PSI , DH and ADH
5、 of the wheat germ proteins hydrolysates were measured. The results showed that the substrate concentration of wheat germ protein was S 3.5%, alcalase dosage was E/S 400 0 U/g, neutral dosage was E/S 100 0 U/g. Under these conditions, TCA-PSI was 75.49%, DH was 65.18%, and the activation rate of ADH
6、 was 68.37%. These proved that the hydrolysates of wheat germ protein possess of noticeable activity of facilitating alcohol metabolism. Key words wheat germ protein, double enzyme hydrolysis, TCA-PSI, ADH, sobering activity 基金项目：湖南农业大学科学基金项目（ 11YJ17） 收稿日期： 2017-08-23 作者简介： 罗思媛，女， 1996年出生，学士，食品科学 通讯
7、作者： 郭红英 ，女， 1980年出生， 讲师， 农产品加工 2 小麦胚芽是小麦发芽及生长的器官之一，同时作为小麦生命的根源，是小麦中营养价值最高的部分 1，其又名麦芽粉、胚芽，呈金黄色颗粒状，约占整个麦粒的 2%3%。麦胚含有丰富而优质的蛋白质、脂肪及多种维生素、矿物质等多种营养素，是优秀的人类营养素来源 2。小麦胚芽氨基酸组成合理， 必 需 氨基酸的相互比值与FAO/WHO 颁布的建议模式相似，其中赖氨酸 人类第一限制氨基 酸的含量十分高3。此外 Yiqiang Ge 等 4和 Irakoze Pierre Clzver等 5经过研究均发现麦胚蛋白具有很好的溶解性、乳化性、起泡性和持水性，
8、不仅可作为畜肉制品的添加剂，以改善食品的结构和口感，还可强化食品营养。 近年来，国内外许多学者因麦胚蛋白的众多优点而产生了浓厚研究兴趣，并针对其酶解工艺及酶解产物的功能活性进行了广泛的研究。张丽霞等 6研究了碱性蛋白酶与胰蛋白酶双酶组合水解麦胚蛋白质的工艺及水解产物清除自由基的活性。程云辉等7利用超滤法将抗氧化活性肽从麦胚蛋白酶解 物中初步分离纯化，并比较了超滤前后麦胚蛋白酶解物的氨基酸组成、相对分子质量分布以及抗氧化活性，确定了最优工艺参数。与此同时，国内有部分学者利用酶法或非酶法对麦胚蛋白饮料及氨基酸营养液进行研究与制备，以及以麦胚为原料研究开发了促进钙吸收、降胆固醇、降血压、抗氧化等生物
9、活性肽 ，但尚未发现对麦胚多肽 的 醒酒活性 进行 研究。 酒精引起细胞损伤的因素是多方面的，其中 乙醇脱氢酶（ Alcohol dehydrogenase, ADH）活性降低是酒精引起细胞损伤的主要因素之一 。 ADH 是乙醇代谢过程中的关键酶，氧化型辅酶 I（ NAD+）作为乙醇代谢过程的氢受体与辅酶，是乙醇分解与代谢的必要酶，而多肽可以激活 ADH 活性并且提高血液中丙氨酸与亮氨酸浓度进而产生稳定的 NAD+。 近年来，国内外学者对醒酒肽的研究也日益增多，如； ZL Ma等 8利用高效液相色谱 质谱 /质谱法鉴定了一种促进酒精代谢的玉米肽；王真真等 9对富硒玉米肽和普通玉米肽的醒酒活性进
10、行了研究，并发现前者的功效优于后者； XC Pan等 10评价了玉米低聚肽 (COP)和姜黄素单独或联合应用对小鼠酒精性损伤的影响及醒酒作用；刘晶晶等 11以河蚬肉为原料，系统研究了醒酒肽的 最佳酶解工艺；宁庆鹏等12通过 Alcalase 蛋白酶制备了具有醒酒作用的花生粕醒酒肽； LE Seber 等 13进行了大豆醒酒肽的纯化及特性研究。 为 高效 利用麦胚资源，本文采用双蛋白酶酶解工艺，研究麦胚 蛋白 酶解物的 体外 醒酒活性， 以期 为麦胚 等富含 蛋白质 的 农副 产品 资源的深度开发和利用提供理论依据。 1 材料 与方法 3 1.1 试验材料 小麦胚：由中央储备粮株洲直属库提供，经
11、干燥、脱脂、粉碎后备用。 无水碳酸钠、浓盐酸、氢氧化钠、甲醛、三氯乙酸、四氯化碳、硫酸铜、氢氧化钾、酒石酸钾钠等，均为分析纯，购自中国医药（ 集团）化学试剂有限公司；碱性蛋白酶、中性蛋白酶：购自丹麦诺维信公司。 1.2 仪器设备 ZN-400A 型高速中药粉碎机：长沙市岳麓区中南制药机械厂； 80 目标准筛：浙江上虞市道墟筛具厂； DK-98-IIA 型恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司； 78-2型双向磁力搅拌器：常州市华普达教学仪器有限公司； pHS-3C 型 pH计：上海精密科学仪器有限公司； LXJ-IIB型低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂； WFJ 7200型可见分光光度计
12、：尤尼柯（上海）仪器有限公司。1.3 试验方法 1.3.1酶解工艺流程 麦胚混合液 添加 Na2CO3 调 pH值 碱性蛋白酶水解 钝化蛋白酶 (95 ， 10 min) 中性蛋白酶水解 钝化蛋白酶 (95 ， 10 min) 调节 pH至 肽得率 等 电点 离心 麦胚蛋白酶解液 水解度 ADH激活率 1.3.2麦胚的预处理及双酶酶解 称取一定量的麦胚粉 (过 80目筛 )，将 预 处理方式作为实验变量，共含五种形式：热变性（ 80 水浴加热 30 min）、微波处理（ 750 W， 30 s）、添加 5% Na2CO3溶液、剪切混合乳化处理（ 150 0 r/min， 20 min）以及未处
13、理 参照样品 ，保证其它反应条件相同，对这五种麦胚蛋白溶液进行 Alcalase 酶解，酶解条件为：蛋白质浓度 2.5%、温度 为 50 、 pH为 9.0、 Alcalase加 酶 量 E/S为 400 0 U/g、酶解时间 为 2.0 h。 随后对五种麦胚蛋白酶解液进行 水解度（ DH%） 测定，以筛选较佳的预处理方式。 4 将预处理后的麦胚蛋白酶解液 水浴（ 40 ）振荡 10 min，调 pH值至蛋白酶最适酸碱环境，按试验所需酶量加入蛋白酶并置于一定温度的恒温培养振荡器中进行酶解。水解至设定时间后，将酶解液放入 95 的热水中水浴 10 min。冷却至室温后，将其 pH值调至 4.0，
14、然后离心（ 500 0 r/min） 12 min，将所得上清液 pH调至 7.0后即获得麦胚蛋白酶解液。 1.3.3肽得率的测定 采用双缩脲法测定水解液中酸溶性肽含量 14。 （ 1）标准曲线的绘制。 以牛白蛋白作为标准蛋白质样，分别称取 40、 50、 60、70、 80、 90、 100、 110 mg于 8支 50 mL纳氏比色管中，然后各加入 1 mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至 50 mL，振摇 10 min，静置 1 h，取上层清液离心 5 min，取离心分离后的透明液于比 色皿中。在 560nm波长下测定各溶液的吸光度 A，绘制牛血清白蛋白浓度 X与吸光度 Y之间的关
15、系曲线： Y = 1.152*X -0.030， R = 0.992 。 （ 2）酸溶性肽含量的测定。 准确量取麦胚蛋白水解液 10 mL与 10%TCA 10 mL，将二者混匀，静置 20 min 后，在 400 0 r/min条件下离心 15 min，用双缩脲测定上清液中的酸溶性肽含量。每个样品做三个平行试验。 1.3.4 肽得率（ TCA-PSI）的计算 水解后产生的酸溶性肽用双缩脲法测定 15,16，原料中蛋白质含量用凯氏定氮法 测定，肽得率（ TCA-PSI/%） =酶解液中酸溶性肽含量 /原料中蛋白质含量 100% 1.3.5 游离氨基氮含量的测定 采用 甲醛电位滴定法 16。 1
16、.3.6 水解度（ DH）的计算 用甲醛电位滴定法测定水解液中游离氨基氮含量 17，用凯氏定氮法测定总氮含量，再按下式计算水解度： 水解度（ DH%） =游离氨基氮含量 /总氮含量 100% 1.3.7 体外乙醇脱氢酶（ ADH）激活率的测定 体外 ADH激活率的测定 采用用瓦勒一霍赫法进行 18。 将 1.5 mL 焦磷酸缓冲溶液（ pH为 8.8） 、 27 mmol/L氧化型辅酶 (NAD)1.0 mL及 11.5%的乙醇溶液 0.5 mL加入试管中，再加入 样品溶液 0.1 mL，混匀后 25 水 浴 5 min 后 ，立即加入 0.25 u/mL乙5 醇脱氢酶（ ADH） 0.1 m
17、L，摇匀 后 于 340 nm处测定吸光度，每 10 s读数一次， 连续测定 5 min。 激活率（ %） =（加 样组 酶活力 空白 组酶活力） /空白 组酶活力 2 实验结果与分析 2.1 麦胚成分分析 对 处理后待用的原料 小麦胚进行成分分析 ， 结果显示，蛋白质、脂肪、水分含量分别为 28.73%， 2.29%， 14.54%，碳水化合物为 50.16%， 灰分为 4.28%。 2.2 预处理的影响 因为蛋白酶难以水解天然蛋白质分子中紧密的立体结构，所以对麦胚蛋白质进行预处理有一定意义，以破坏其高级结构，暴露出那些易与酶发生作用而又处于分子内部的部位，故而在一定程度上增加蛋白水解酶的作
18、用位点，加快酶解速率 19-21。 麦胚蛋白酶解液经五种方式预处理后的 水解度（ DH%） 如图 1所示。 图 1 预处理对 碱性蛋白酶 酶解的影响 从图 1显示结果可得知，添加碳酸钠 溶液 和剪切乳化 两种 预处理 方式对促进 麦胚蛋白 水解、 提高水解度（ DH%） 均具 有明显作用， 且 前者比后者高 1.51%；与未处理的样品相比， 麦胚蛋白的水解度提高了 42.49%。 究其原因 可能 是 因为碳酸钠是强碱弱酸盐， 在麦胚水溶液中解离出使溶液呈碱性的 OH-离子，影响麦胚蛋白中部分基团的解离程度，破坏组成蛋白质分子的非共价键，将原本严密且有序的空间结构变得杂乱松散且无序，致使蛋白质分
19、子内部的疏水基团暴露到分子的表面，增强其疏水性 22。6 同时， Na2CO3 溶液使麦胚中与蛋白质结合的淀粉颗粒产生溶胀，最后胀破，使蛋白质分子释放出来。 2.3 Alcalase酶解条件的探究 2.3.1 加酶量的影响 5份 20 mL蛋白质 浓度为 2.5%的 麦胚溶液，经碳酸钠处理后，在 pH 为 9.0、温度为 50 、 碱性蛋白酶加酶量分别为 200 0、 300 0、 400 0、 500 0、 600 0 U/g条件下酶解 2.0 h的试验结果如下。 图 2 加酶量对 碱性蛋白酶 酶解的影响 由图 2可知，随着 Alcalase加酶量的增加， TCA-PSI、 DH与 ADH激
20、活率均呈先增加后减少的趋 势，且三者均在加酶量为 E/S为 400 0 U/g时达到最大值。可见，Alcalase添加 量对 TCA-PSI、 DH与 ADH激活率的影响较大。 当 E/S在 200 0 400 0 U/g时， 随着加酶量的增加，蛋白质被分解为小分子肽，因此 TCA-PSI、 DH与 ADH激活率均逐渐增加 ； 当加酶量 E/S大于 400 0 U/g时，体系反应的初速度不断增大，这使得 一 部分大分子蛋白在较短时间内被降解成为 多肽， 而后其与蛋白质形成竞争关系，进而形成氨基酸，抑制酶解进程，从而 导致TCA-PSI、 DH与 ADH激活率水平 出现下降趋势 。 因而 Alc
21、alase加酶量应控制在 400 0 U/g以内。 2.3.2 酶解时间的影响 5份 20 mL蛋白质浓度为 2.5%的麦胚溶液，经碳酸钠处 理后，在 pH 为 9.0、温度为 50 、按碱性蛋白酶加酶量 为 400 0 U/g条件下，酶解时间分别为 0.5、 1.0、 1.5、2.0、 2.5 h，所得试验结果如下。 7 图 3 酶解时间对 碱性蛋白酶 酶解的影响 由图 3可知， Alcalase的酶解过程中，当酶解时间低于 2.0 h时， TCA-PSI、 DH与 ADH激活率和酶解时间呈正相关 ， 1.5 2.0 h期间酶解速率达到最大值 ； 2.0 h之后， TCA-PSI、 DH、
22、ADH激活率 均出现不同程度的下降。 分析原因可能是 随着时间的延长，原料中的淀粉颗粒溶胀，包埋了部分 蛋白质 和 已降解的多肽，使底物暴露的可降解作用位点减少所致。 因此确定最佳水解时间在 2.0 h。 2.3.3 蛋白质浓度的影响 如图 4所示的为 5份 20 mL 蛋白质浓度分别为 1.5%、 2.0%、 2.5%、 3.0%、 3.5%的麦胚溶液，经碳酸钠预处理后， 在 pH为 9.0、温度为 50 、碱性蛋白酶加酶量 E/S为 400 0 U/g条件下酶解 2 h的试验结果。 图 4底物浓度对 碱性蛋白酶 酶解的影响 由图 4可以看出，随着蛋白质浓度的增加，水解度也呈逐渐增加的趋势，
23、其中，8 当蛋白质浓度为 2.5% 3.0%时，出现了增速减缓的 趋势， 3.0%水平的水解度仅仅比前一个水平增加了 3.66%。但蛋白质浓度增加至 3.5%后，水解度剧增，达到了 75.83%。肽得率则呈现出不一样的趋势，在蛋白质浓度为 1.5% 3.0%的范围内，肽得率随着浓度的增加而增加，当浓度大于 3.0%时，肽得率出现下降趋势，且低于总体的平均值。而 ADH 激活率在蛋白质浓度为 2.5%时达到最大值，在 1.5% 2.5%范围剧增，在 3.0% 3.5%范围内剧降，但当浓度为 3.0%时仍高于平均值。 由以上数据 可 推断 ，过低的蛋白浓度会降低 其 与蛋白酶的 触碰 机 会 ，
24、不利于酶 解反应 的进行 23。 故在低浓度范围内，随着底物蛋白浓度的升高，有利于酶解的进行，TCA-PSI、 DH与 ADH激活率 会呈上升趋势； 当蛋白质浓度 继续增大时，酶解过程中生成的多肽 与蛋白质竞争蛋白酶的作用位点， 参与酶解反应，进而被 水解为 寡肽或 氨基酸 ，所以 TCA-PSI在底物浓度超过 3.0%时 会出现减少趋势，同时， ADH激活率 下降， 可推断 具有较强醒酒活性的多肽其氨基酸构成较多，而非寡肽或氨基酸。综合考虑，后期试验 控制蛋白质浓度 为 3.0%较 佳。 2.4 Neultral酶解条件的探究 2.4.1 加酶量的影响 5份 20 mL 蛋 白质浓度为 3.
25、0%的麦胚溶液，经碳酸钠处理后，在温度为 50 、pH 为 9.0、按 Alcalase加酶量为 400 0 U/g条件下，酶解 2.0 h后， 95 下灭酶 10 min。按 Neutral加酶量分别为 500、 700、 900、 110 0、 130 0 U/g，酶解时间为 2.0 h的试验结果如下所示。 图 5 加酶量对双酶酶解的影响 由图 5可知，随着中性蛋白酶酶用量的增加， TCA-PSI与 DH呈现同增同减的趋9 势， ADH激活率在 140 0 180 0 U/g范围内与前两者增减趋势略有不同。当加酶量E/S增加至 100 0 U/g时，三者均达到最大值。当酶用量 E/S在 2
26、00 100 0 U/g范围内时， TCA-PSI逐渐增加，此时大分子蛋白质被分解为小分子肽并随酶用量的增加，酸溶性肽含量增加；同时， DH也呈上升趋势，中性蛋白酶与碱性蛋白酶协同作用下，小分子肽被进一步水解为游离氨基酸，因而 DH增加。当 TCA-PSI与 DH增加至一定程度后，对中性蛋白酶的酶解作用产生了一定的抑制作用，因而当加酶量 E/S高于100 0 U/g时， TCA-PSI、 DH逐渐降低，降幅较大。综合考虑经济成本与试验效果，选择 Neutral酶解试验加酶量 E/S为 100 0 U/g。 将图 5参照前文中的图 2可知，与 Alcalase单酶酶解试验相比，双酶酶解产物的DH
27、与 TCA-PSI总体高于单酶酶解产物，其中 DH平均值高出 9.88%， TCA-PSI则高出 11.17%，可见双酶酶解工艺比单酶酶解的效果更优。 2.4.2 酶解时间的影响 5份 20 mL蛋白质浓度为 3%的麦胚溶液，经碳酸钠预处理后，在温度为 50 、pH为 9.0、按 Alcalase加酶量为 400 0 U/g条件下，酶解 2.0 h后， 95 下灭酶 10 min。按 Neutral加酶量为 900 U/g，酶解时间分别为 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5 h后，所得试验结果如下所示。 图 6 酶解时间对双酶酶解的影响 由图 6可知，酶解时间为 0.5 h时， T
28、CA-PSI、 DH与 ADH激活率均为最低值，且均低于平均值，在 0.5 1.0 h这段时间内，反应速率最高，三者数值均增加，且 DH的增幅较大。 1.0 h时 TCA-PSI、 DH与 ADH激活率分别增加了 3.02%、 5.94%、 16.86%。1.5 2.5 h时间内， TCA-PSI、 DH与 ADH激活率的变化幅度较小，整体趋于平稳。10 其中， DH与 TCA-PSI的峰值出现在 1.5 h处，此时肽得率达到 81.28%，水解度达到68.52%。 这可能是因为蛋白质中与酶接触的机率大幅下降以及可供酶切的位点大幅减少。此外，水解反应产生的大量酶解物也有可能抑制 Alcalas
29、e 与 Neutral 的作用 23。故应选择 1.5 h为 Neutral最佳酶解时间。 将图 6参照于前文中的图 3可知，双酶酶解试验的 TCA-PSI与 DH均比单酶酶解试验的高出将近一倍，其中 TCA-PSI、 DH的平均值分别增加 21.46%、 24.07%。 2.5 正交试验 综合以上试验数据可知， Alcalase 与 Neutral 双酶复合酶解麦胚蛋白工艺优于Alcalase单酶酶解工艺。且 Neutral酶解工艺最优条件为：蛋白质浓度 3.0%、温度 50 、pH7.0、加酶量 E/S为 100 0 U/g、时间 1.5 h。 综合 Alcalase添加量、酶解时间、 底
30、物浓度（麦胚蛋白浓度）及 Neutral添加量、酶解时间等对麦胚蛋白酶解及对 ADH激活率的 影响，可见 Alcalase与 Neutral双酶酶解 工艺优于 Alcalase单酶酶解 ，为获取最佳的 酶解工艺条件 ， 选取 底物浓度、 Alcalase加酶量、 Neutral加酶量 这三个 影响显著、变化呈一定趋势的 因素 ， 以麦胚蛋白的水解度 、 肽得率 及 ADH 激活率 为指标 ， 进行正交试验 以 确定最佳酶解工艺条件。正交试验的因素水平以及结果分别见表 1、表 2。 表 1 正交试验设计的因素及水平 表 2正交试验设计方案及结果 水平 A：底物浓度 /% B： Alcalase 添加量 /(U/g) C： Neutral添加量 /(U/g) 1 2.5 240 0 700 2 3.0 320 0 100 0 3 3.5 400 0 130 0 序号 因素 肽得率 /% 水解度 /% ADH 激活率 /% A B C 1 1 1 1 69.18 51.21 56.02 2 2 2 2 73.36 55.39 59.36
