面包酵母生物催化不对称合成丹参素冰片酯.DOC

1、面包酵母生物催化不对称 合成丹参素冰片酯 匡新谋 1 ,孙颖 2, 白亚军 2,南叶飞 3,郑晓晖 2* （ 1 宁波 职业技术学院 化工学院 ，浙江 宁波， 315800 ； 2 西北大学 生命科学学院，陕西 西安， 710069； 3 西安石油大学 化学 化工学院，陕西 西安， 710065 ） 摘要： 本文 以 3,4-二羟基苯甲醛为原料 ， 经 Knoevenagel 缩合、水解 反应 合成 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸，利用对甲基苯磺酸催化 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸和冰片反应合成 了 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸冰片酯 ， 最后 利用 面包酵母 生物 催化 不对称 合

2、成了丹参素冰片酯 （ DBZ） 。系统考察了 葡萄糖 加入量、反应时间 、 pH及 -环糊精 加入量等因素 对 面包酵母生物催化合成不对称丹参素冰片酯的影响，结果表明：在底物 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸冰片酯 加入量 为 0.5g 时，其最佳反应条件为 ： 葡萄糖 30g、 -环糊精 1.5g、 pH 为 7、 反应时间 24h，此 条件下 对映体过量值 （ ee 值） 高达 84.9%，产物主要为 S 构型的丹参素冰片酯。该工艺条件 温和、成本较低，是一条极具价值的 丹参素冰片酯生产工艺。 关键词： 面包酵母； 生物催化； 不对称 还原 ； -环糊精；丹参素冰片酯 Study on B

3、iosynthesis of Asymmetric Synthetic Danshensu Borneol ester by Baker s Yeast ( KUANG Xin-mou1, SUN Ying2, BAI Ya-jun2,NAN Ye-fei3, ZHENG Xiao-hui2) (1 School of chemical engineering ,Ningbo Ningbo Polytechnic,Ningbo 315800,ZheJiang,China;2 College of Life Sciences,Northwest University, Xian 710069,

4、Shan Xi,China;3 College of Chemistry and Chemical Engineering, Xian Shiyou University, Xian 710065, Shan Xi, China) Abstract： In view of the disadvantages of high cost、 hash experimental conditions and low utilization rate of raw materials in existing reports. In the paper, 3,4-dihydroxybenzaldehyde

5、 was used as raw material, refer to the literature method, and -(3,4-dihydroxyphenyl) pyruvate borneol ester was synthesized at first, then under the breads yeast fermentation liquid and target product Danshensu borneol ester was synthesized. The influence of amount of glucose and -cyclodextrin、reac

6、tion time 、 pH were investigated in the paper. When -(3,4-dihydroxyphenyl) pyruvate borneol ester was 0.5g , And the best conditions were as follow: amount of glucose was 30g , reaction time was 24h, pH was 7, amount of -cyclodextrin was 1.5g. enantiomeric excess valve of the target product as high

7、as 84.9%,and main configuration was S-DBZ . The reaction conditions of the process in this paper were mild and the cost was low, which was a very valuable process for the production of Danshensu borneol ester. Key word: Bakers yeast; Biocatalytic;asymmetric reduction; -(3,4-dihydroxyphenyl) pyruvate

8、 borneol ester;Danshensu Borneol Ester 基金项目 ： 1 超临界流体色谱的开发与应用（ 2013YQ170525;子项目：超临界流体色谱在中药及其代谢物中的应用研究， 2013YQ17052509） ； 2 中国长江学者课程和教育部大学创新研究团队（ IRT_15R55） Foundation item: 1The Development and Application of Supercritical Fluid Chromatography (2013YQ170525; subproject: Application Research of Super

9、critical Fluid Chromatography in Chinese Traditional Medicine and Its Metabolites, 2013YQ17052509) ；2Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University of Ministry of Education of China (IRT_15R55) 作者简介： 匡新谋（ 1983-），男， 工程师 ，硕士； 联系人： 郑晓晖 （ 1968-） ， 男，博士， 西北大学 教授， 电话： 029-88302

10、686， E-mail: 丹参素冰片酯（简称为 DBZ）是 西北大学郑晓晖课题组在丹参素结构上引入冰片结构而设计合成的新化合物 1。 相关研究表明 ， DBZ具有抗动脉粥样硬化 2-3、抗心脑缺血 4、降低血压、改善心脏舒张功能 4等作用。 我国科研工作者在 如何高效 且 低成本的制备 DBZ方面 做了大量的工作 。郑晓晖 1以 3,4-二羟基苯甲醛为原料 ，率先用 锌汞齐 5将羰基还原合成了混旋 DBZ，但该工艺存在 锌汞齐 5毒性大以及收率低 等缺点 。 张群正 6以 3,4-二羟基苯甲醛为原料， 经苄基保护、 Darzens环氧化 7、 Lewis 酸开环、 NaBH4还原、催化加氢脱

11、保护 得到了混旋的 DBZ，此工艺路线 存在反应条件相对苛刻且成本较高等缺点 。 田海林 8、陈明 9分别 以 3,4-二羟基苯甲醛为原料，先后经苄基保护、 Knoevenage缩合 10、酰化得到酰氯，再与相应的醇反应得酯，然后通过Sharpless不对称双羟化反应 11构建手性中心，再经选择性催化加氢， 最后脱保护 分别 得到 了光学纯度较高的 丹参素异丙酯及 DBZ，此方法也存在实验条件苛刻 、 成本高 的缺点 ； 刘佩 12和 白亚军 13利用不同方法先 得到混旋 DBZ，最后经超临界流体色谱法分离纯化得到 了 光学纯度较高的 DBZ，该方法 也存在 手性拆分成本高 、原子利用率 低等

12、缺点 。因此，寻求一条反应条件温和、成本低 、绿色环保 的 DBZ合成工艺具有重大的研究意义。 面包酵母 含 有 丰富的氧化还原酶 ， 可催化多种羰基化合物的不对称还原 ，使用面包酵母全细胞催化反应，只需添加廉价的碳源就能使细胞再生出价格昂贵的辅酶，因此能极大的降低生产成本 14。 杨忠华 15和马小魁 16等 通过 在 面包酵母中添加手性添加剂 ， 实现了羰基化合物 的 不对称还原 。 本 文 在 合成出 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸冰片酯的基础上 ，通过面包酵母不对称还原合成 了 DBZ， 目前 本工艺 方法 还未见报导 。 探讨了 葡萄糖加入量、反应时间、 pH及 -环糊精加入量等因

13、素 对 面包酵母生物催化 过程的 影响，得到了一条反应条件温和、绿色环保 、 成本相对 较 低 的 DBZ制备工艺，是一条极具价值的丹参素冰片酯生产工艺。 1 实验部分 1.1 主要试剂与仪器 3,4-二羟基苯甲醛 (CP, 广西省化工总公司进出口公司 )；面包酵母为市售的常见的安琪面包酵母； (R )- DBZ 和 (S )- DBZ标准样品为西北大学中草药现代化工程与研究中心提供；其他样品为市售 CP。 红 外光谱仪 (FTIR360，美国 Nicolet仪 器公司 )；高效液相色谱仪 (Agilent 1100 series，美国 Agilent科技有限公司 )； 核 磁 共 振 仪 (

14、INOVA-400 MHz，美国 Varian 公司 )。 1.2 面包酵母生物催化不对称合成 DBZ DBZ合成 路线 图如下： 以 3,4-二羟基苯甲醛 、甘氨酸 为原料 ，在醋酸酐及醋酸钠作用下 经 Knoevenagel 缩合、盐酸 水解合成 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸， 再利用对 甲基苯磺酸催化 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸和冰片反应合成 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸冰片酯 ，最后用面包酵母生物 催化不对称合成DBZ。 1.2.1 2-甲基 -4-(3,4-二乙酰氧基苄叉基 )噁唑酮 ( )的制备 参考文献 13， 得深黄色固体，即为 目标化合物 ， 收率 67.5%。

15、 1.2.2 -乙酰氨基 -(3,4-二乙酰氧基苯基 )丙烯酸 ( )的制备 参考文献 13， 得黄色粉末，即为 目标化合物 ， 收率 78.9%。 1.2.3 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸 （ ） 的制备 参考文献 13， 得白色晶体，即为 目标化合物 ， 收率 43.5%。 1.2.4 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸冰片酯 ( )的制备 向装有搅拌 器 的 1 L三口烧瓶中分别加入 化合物 ( 10 g)、 化合物 (11 g)、 对甲苯磺酸(1.65 g)、 甲苯 (250 mL)，回流反应 12.5 h。旋蒸 出甲苯 ， 加入乙酸乙酯 (150 mL)溶解 ， 经 饱和 NaHC

16、O3 溶液洗涤至 有机相 pH 为 56，无水 Na2SO4 干燥 ，经 浓缩 、 石油醚结晶 、 抽滤、晶体 干燥 处理 后得黄色固体 9.35 g，即为 化合物 ，收率 55.3%。 1.2.5 pH 为 7的 Na2HPO4和 NaH2PO4缓冲溶液的配置 准确称取 Na2HPO4 12H2O (4.45 g)， NaH2PO4 2H2O (4.48 g)，配成 500 mL 的溶液，得到 pH为 7的缓冲溶液。 1.2.6 DBZ的制备 在 30 恒温水浴中， 向 装有搅拌 器 的 1 L三口烧瓶中分别 加入面包干酵母 (30 g)、 葡萄糖(30 g)、 -环糊精 (1.5 g)、

17、预先配置好的 缓冲溶液 (250 mL)，搅拌预处理 6 h后，加入 化合物 (0.5 g)， HPLC监测反应 。反应结束后， 经 离心 、 乙醚萃取 (4100 mL)后 ，合并有机相，无水 Na2SO4干燥， 经 过柱 V（ 石油醚 ） :V(乙酸乙酯 )=2:1 、旋蒸 ，得 到 DBZ 0.43g， 收率 86%。IR(KBr) /cm-1:3363.61( OH)、 2953.12( CH3)、 2881.54( CH2)， 1725.51(C=O)、 1608.20 、1521.53 、 1450.32( 苯环骨架 ) 、 1281.36(C O) 、 1143.9(C O) 、

18、 885.71 、 805.68(1,2,4-苯环三取代 )； 1HNMR(DMSO-d6, 400MHz,)， :8.64 8.75(m,2H ,AR OH) , 6.42 (m,1H, AR H,Hc处 H)， 6.56 (m,1H, AR H,Hb处 H), 6.58 (m,1H, AR H,Ha处 H)， 5.45(m,1H, CH2CH OH)， 4.83(m,1H, COOCH)， 4.10(t, J=12Hz,1H, CH(OH)， 2.602.70(m,1H,Ph CHa )， 2.70 2.80(m,1H,Ph CHb ), 0.60 2.40(m,冰片上的氢 )。 利用文献

19、 13提供的 HPLC检测方法 （方法 B） ：保留时间为 33.1min的物质为 S-DBZ， 在HPLC上的峰面积记为 St1， 保留时间为 36.3min的物质为 R-DBZ，其峰面积记为 St2，本 文 中S-DBZ及 R-DBZ的 ee计算方法 分别按照 公式 （ 1） 及 （ 2） 计算 。 ee= St1St1+St2100% 公式（ 1） ee= St2St1+St2100% 公式（ 2） 2 结果与讨论 2.1 面包酵母对催化过程的影响 实验 发现 ， 纯面包酵母反应体系， ee值为 0，且化合物 不能反应完全，说明纯面包酵母体系中氧化还原酶 的 活性 及 选择性 均比较差

20、。 这是因为 面包 酵母细胞中存在至少两种能催化同一底物还原生成不同对映异构体的酶，因此纯面包酵母 反应体系 的立体选择性不高 17-18，如果能够抑制 生成 不需要的对映异构体的酶 产生 ，就可以提高反应的立体选择性 15。 面包酵母催化反应体系 通常需要作为电子供体的辅酶 NAD(P)H 参与，但细胞中 NAD(P)H 的含量非常低，因此必须 含有 再生还原型辅酶 NAD(P)H才能使反应持续顺利进行 ，有学者指出 ，葡萄糖 15及 -环糊精 16能够促进 产生 再生还原型辅酶 NAD(P)H。 2.2葡萄糖对催化过程的影响 图 1为 不加入 -环糊精 ，当 面包酵母加入量为 30g，变化

21、葡萄糖加入量，其他实验方法同 1.2.6条件下得到的数据 。 根据 白亚军 13的 HPLC方法分析， 本论文方法生成的 主要产物为S-DBZ，说明葡萄糖在反应过程中能够抑制面包酵母内 生成 R-DBZ需要 的酶的产生。很多学者 （ 例如杨忠华 ） 发现 ， 活性酵母细胞可以利用葡萄糖在代谢过程中产生还原型 NAD(P)H，进而提高面包酵母催化过程的立体选择性 15；本 文 验证了 葡萄糖 能提高产物立体选择性的说法。 蔡明建发现，面包酵母活性与其浓度有关，当面包酵母浓度在一定范围内增加时，也能提高其氧化还原酶的浓度 18； 由图 2可知，当面包酵母加入量 固定 为 30g时 ， 葡糖糖加入量

22、达到 30g并继续增加时， ee值不再变化 。 因此， 上述 实验条件 下 ，葡萄糖的最佳加入量为30g。 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40051015202530eevalve(%)q u a li t y o f g luc o s e ( g )图 1 葡萄糖加入量对 ee值的影响 Fig1 quality of glucose on the enantiomeric excess valve of DBZ 2.3 pH值对催化过程的影响 图 2为葡萄糖加入量为 30g， -环糊精 加入量为 1.5g， 变化 pH值 ，其他实验方法同 1.2.6条件下得到的数据 。

23、 通过不同 pH值的缓冲溶液，考察了 pH值 对催化过程的影响 ， 从图 2可以看出， 当 pH值 逐渐提高时， ee值呈现先升后降 的趋势； 当 pH值从 4增加到 7时， ee值从 11.7%迅速增加到最高的 84.9%；继续提高 pH值时， ee值迅速降低。 因此， 不同 pH值 对催化过程存在很大的影响， 这 可能 是由于 中性的 pH值环境对面包酵母没有毒害作用， 而 过低或者过高的 pH值环境 能够抑制面包酵母 酶的 活性 所致 。 因此， 上述实验条件下 ， 最佳的 pH值为 7。 4 5 6 7 8 9102030405060708090eevalve(%)pH图 2 pH值对

24、 ee值的影响 Fig2 Effect of pH valve on the enantiomeric excess valve of DBZ 2.4 -环糊精 加入量对催化过程的影响 图 3为葡萄糖加入量为 30g， pH值为 7，变化 -环糊精 加入量 ，其他实验方法同 1.2.6条件下得到的数据 。 考察了 -环糊精加入量对催化过程的影响， 从图 4可以看出， 当 -环糊精加入量逐渐提高时， ee值呈现先升高后平稳的趋势。当 -环糊精加入量从 0 g增加到 1.5 g时，ee值从 25.5%迅速增加到最高的 84.9%；继续提高 -环糊精加入量时， ee值趋于稳定， 因此不同 的 -环糊

25、精加入量对 面包酵母不对称还原 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸冰片酯为 DBZ存在很大的影响。 -环糊精能显著 提高 面包酵母 催化效果 ， 这是由于 -环糊精为多糖 ， 对面包酵母细胞没有毒害作用， 进而能更好的保持面包酵母细胞的活性 19； -环糊精还可能通过抑制或活化催化生成某种对映异构体的酶 进而 提高 了 反应的立体选择性 16。 因此 ， 上述实验条件下，最佳的 -环糊精 加入量为 1.5g。 0g 0 .5 g 1g 1 .5 g 2g2030405060708090eevalve(%)q u a li t y o f - c y c lod e x t r in ( g )图

26、 3 -环糊精加入量对 ee值的影响 Fig3 quality of -cyclodextrin on the enantiomeric excess valve 2.5 反应时间对 催化过程的影响 图 4为葡萄糖加入量为 30g， pH值为 7， -环糊精 加入量 为 1.5g， 变化 反应 时间， 其他实验方法同 1.2.6条件下得到的数据 。 考察了反应时间对 催化过程的影响 ，结果见图 4。 从图 4可知， 随着反应时间的增加， ee值逐渐提高，然后趋于稳定。 反应 18h后 ， ee值为 77.2%， 24 h后 ， ee值达到最高 （ 84.9%） ， 再延长反应时间， ee值基本

27、不变并有下降的趋势。 因此，上述实验条件下，最佳的 反应时间为 24h。 18h 20h 22h 24h 26h77787980818283848586eevalve(%)r e a c t ion t ime ( h )图 4 反应时间对 ee值的影响 Fig 4 Effect of reaction time on the enantiomeric excess valve of DBZ 2.6其他手性添加剂对催化过程的影响 在文献 16中，除了 -环糊精 ，还报导了其他的手性添加剂，如：硅藻土、 L-半胱氨酸等。本 文 发现，以硅藻土作为手性添加剂 时 ，按照文献 13提供的 HPLC方

28、法检测，有 S-DBZ及 R-DBZ生成， S-DBZ的 ee值最高达 47%，这与文献 16中 得出 的硅藻土可以提高面包酵母发酵液立体选择性结论一致；以 L-半胱氨酸作为手性添加剂 时 ，按照文献 13提供的 HPLC方法检测，同样有 S-DBZ及 R-DBZ生成， S-DBZ的 ee值最高达 52%，但这两种手性添加剂与上文中的 -环糊精 相比， ee值明显偏低。 所以，本文选取 -环糊精 作为手性添加剂进行实验。 3 结论 本 文 以 3,4-二羟基苯甲醛为原料， 参照文献先 合成 化合物 ，然后直接向面包酵母发酵液中加入手性添加剂， 生物 催化 化合物 不对称还原合成了 DBZ。 考

29、察了 多种 因素对面包酵母生物催化过程的影响 ， 结果表明 ：当 底物 -(3,4-二羟基苯基 )丙酮酸冰片酯 加入量为 0.5 g时 ，在 pH为 7的反应条件下，加入 30g葡萄糖 、 1.5g -环糊精 、 反应 24 h，反应体系的 ee值最高达到 84.9%，主要产物为 S-DBZ。 与 现有 的 DBZ制备 工艺相比， 本工艺 是一条反应条件温和、绿色环保、成本相对低的 DBZ制备工艺。 如本论文所述， 利 用 未经活化的 面包酵母 能生物催化 不对称催化合成 DBZ， 然而本方法也存在底物浓度不高的缺点 ； 未来 ， 可以在本论文方法的基础上， 继续 考察 其他的手性添加剂 对面

30、包酵母生物催化过程的影响 ，如： 有机溶剂、表面活性剂等 ；还 可以 再进一步， 利用活化处理后的面包酵母 ， 或者 筛选出面包酵母中的氧化还原酶 等方法 ， 以 进一步 提高 面包酵母 生物催化 不对称合成 DBZ的 能力 。 参考文献 1 ZhengXiaohui(郑晓晖 ), ZhangQunzheng(张群正 ), Wang Shixiang(王世祥 ), et al. CN 1868998P, 2006， 2006-11-29 . 2 Li Jin(李静 ), Zhou Jie（周洁） , Liu Qin-she（刘勤社） , et al. Study on the mechanis

31、m of Danshensu borneol ester about mediated intervention of TLR4 signaling pathway on anti-atherosclerosisJ. Shaanxi Journal of Traditional Chinese Medic ine（陕西中医） , 2012,33( 5) : 627-636 3 Li Jin(李静 ), Liu Yarong（刘亚荣） , Liu Qin-she（刘勤社） , et al.Experimental study on the expression of TLR4, NF-KB an

32、d IL-6mRNA in rat abdominal aortaJ. Journal of Shaanxi Medical(陕西医学杂志 ), 2012,41( 4) : 392-394 4 Liu Shaojing( 刘 少 静 ). Study on struetural charaeterization,quality control and pharmacokinetic of DBZ D.Xi an: Northwest University (西北大学 ),2009 5 Clemmensen, E. Reduction of ketones and aldehydes to th

33、e corresponding hydrocarbons using zinc-amalgam and hydrochloric acidJ.Chemische Berichte ,1913, 46, 1837-1843. 6 Zhang Qunzheng(张群正 ) , Dong Yan(董岩 ), Nan Yefei(南叶飞 ) ,et al. Synthesis of -(3,4-dihydroxyphenyl)-hydroxy propionic acid estersJ. Chinese Journal of Organic Chemistry(有机化学 ), 2009,29(9):

34、1466-1469. 7 Erlenmeyer, E. Phenyl-oxypropionoic acid and phenyl-,-propionic acidJ. Liebigs Annalen der Chemie, 1892, 271,137-163. 8 Tian Hailin(田海林 ) , Zhou Xiaowei(周晓伟 ), Chen Ming(陈明 ) ,et al. Asymmetric of synthesis of Danshensu borneol ester J. Chinese Journal of medicinal chemistry(中国药物化学杂志 ):

35、 2012,22( 2) : 113-116 9 Chen M， Chen H， Wang Y Z， et al Efficient and practical asymmetric synthesis of isopropyl (R) -3-(3,4-dihydroxyphenyl) -2-hydroxypropanoate and its enantiomerJ.Tetrahedron: Asymmetry,2011,22(1) : 4-7 10 Knoevenagel, E. Method for the synthesis of glutaric acid J. Chemische B

36、erichte, 1894, 27, 2345-2346. 11 Hentges, S. G., Sharpless, K. B. Asymmetric induction in the reaction of osmium tetroxide with olefins J. Journal of the American Chemical Society, 1980, 102, 4263-4265. 12 Liu Pei(刘 佩 ), Qin Fanggang(秦方刚 ) , Bai Yajun(白亚军 ) , et al. Synthesis and chiral separation o

37、f isopropyl and bornyl -(3,4-Dihydroxyphenyl)-dydroxypropionateJ. Journal of northwest university(natural of science edition)( 西北大学学报 ： 自然科学版 ): 2015,45(3):413-417. 13. Bai Y J, Zhang Q Z, Jia P, et al Improved process for pilot-scale synthesis of danshensu ( ( ) -DSS) and its enantiomer derivatives

38、 J .Org Process Res Dev， 2014,18( 12) : 1667-1673 14Yang F, Russell A. Optimization of bakers yeast alcohol dehydrogenase activity in an organic solventJ. Biotechnology Progress, 1993 , 9(3):234241. 15 Yang Zhonghua(杨忠华 ) , Yao Shanjin(姚善泾 ) . An effective method for controlling the stereo selectivi

39、ty in asymmetric reduction of -oxo ester with yeast cellsJ. Chinese Journal of Catalysis(催化学报 )， 2004,25(6):805808. 16 Ma Xiaokui (马小魁 ), Wang Jiezhi (王喆之 ), Chen Wuling (陈五岭 ). Asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate to ethyl-4-chloro-3-hydroxybutanoate directly catalyzed by yeast fer

40、mentation brothJ. Chinese Journal of Catalysis(催化学报 )， 2006,27(4):314318. 17 Nakamura K , Kawai Y , Nakajima N , Ohno A. Stereochemical control of microbial reduction. 17. a method for controlling the enantioselectivity of reductions with bakers yeastJ.Journal of Organic Chemistry , 1991 , 56(15):47

41、78-4783. 18 Shieh W R, Gopalan A S , Sih C J . Stereochemical control of yeast reductions. 5. characterization of the oxidoreductases involved in the reduction of &keto estersJ. Journal of the American Chemical Society ,1985 , 107(10)： 2993。 19 Cai Mingjian(蔡明建 ),Wang Guangrong(王光荣 ),Wei Jinfang(魏金芳 ) , et al. Study on catalytic asymmetric reduction of aromatic ketones by baker s yeast J. Chemical Engineering & Equipment(化学工程与装备 ),2010(10):32-35,41.