1、1多类环境内分泌干扰物高效共同测定项目总结报告丁皓 1，吴小东 1，李长于 2（1、浙江省环境保护科学设计研究院，浙江 杭州 310007，2、浙江方圆检测集团股份有限公司，浙江 杭州 310000）摘要：环境中的内分泌干扰物质种类多样、浓度低且来源广、危害大，对环境中的内分泌干扰物进行及时准确检测，能有预防环境中的内分泌干扰物造成的危害，是对内分泌干扰物进行预防和治理的关键步骤。本研究建立了气相色谱质谱联用法测定土壤中环境内分泌干扰物（邻苯二甲酸酯类、己二酸酯类、卤代联苯和烷基酚类）含量的方法，并用于土壤样品的检测。经二氯甲烷超声提取 20 分钟，以 C18 固相萃取柱分离，二氯甲烷丙酮(9
2、:1，V/V)为洗脱溶剂进行洗脱，在合适的色谱质谱条件下进行检测。在不同的加标水平下，样品平均加标回收率(n=6)为 83.19%127.87%，相对标准偏差为 1.46%4.02%，内分泌干扰物定性检测限在 0.0010.013mg/kg 之间，定量检测限在 0.00330.0429mg/kg 之间。该方法能很好地应用于土壤中内分泌干扰物高效定量分析。关键词：环境内分泌干扰物；样品前处理；分析方法；气相色谱质谱法Abstract：The endocrine disrupting substances in the environment are diverse in species, the
3、 characteristics of them are low in concentration and wide in source, and existing for a long time, moerover,they will disrupt the role of organism secretion by a small amount, causing immune deficiency, abnormal growth and development, and even many generations of hazards All kinds of diseases, it
4、is necessary to detect endocrine disruptors in the environment.In this study, the method of gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) for the determination of environmental endocrine disruptors (phthalates, adipates, halogenated biphenyls and alkyl phenols) in soils was established. Detection of
5、soil 2samples. The mixture was extracted by dichloromethane for 20 minutes, separated by C18 column, eluted with dichloromethane acetone (9: 1, V/ V) as elution solvent and tested under suitable chromatographic mass spectrometry conditions. The average standard recoveries (n = 6) were 83.19%127.87%
6、and the relative standard deviations were 1.46%4.02% at different spiked levels. The qualitative detection limit of EDCs was between 0.0010.013mg/kg, and the quantitative detection limit was between 0.00330.0429mg/kg. The method can be applied to the quantitative analysis of endocrine disruptors in
7、soil.Keywords：Environmental Endocrine Disruptors;sample pretreatment;analytical method;GC/MC在 1996 年，欧洲委员会给出了内分泌干扰物的第一个定义：“改变生物体或其后代或（亚）人群内分泌系统功能的外源物质或混合物”。许多以不同化学结构为特征的天然和合成（或半合成）试剂具有破坏调节细胞生长，内环境稳定和发育的正常内分泌过程的潜力 1。美国环保局 1998 年公布的 67 类危及人体和其他生物体的内分泌干扰物名单，这些化合物存在约 86000 种商用化学品中，人群接触几率极大，此类物质在环境中存在时间长
8、，并且只要极少量便会起到扰乱生物体内分泌的作用，造成免疫缺陷、异常生长发育、甚至长达多代的危害等各类疾病。目前，与废弃物污染相关的内分泌干扰物主要有邻苯二甲酸酯类、己二酸酯类、卤代联苯和烷基酚类等。对内分泌干扰物进行及时准确检测，能有预防环境中的内分泌干扰物造成的危害，是对内分泌干扰物进行预防和治理的关键步骤。目前较为常用的快速处理环境样品的萃取技术有：索氏提取、固相萃取、固相微萃取、超声波萃取、微波萃取、加速溶剂萃取和超临界流体萃取等。主要用到的检测方法为气相色谱法（GC-MS ） 、气相色谱质谱联用法（ GC-MS） 、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱质谱联用法（HPLC-MS） 。就
9、目前而言，国内的检测方法主要针对于食品以及日用品等方面，并未充分重视对排放到环境中的干扰物的检测，而且相比较于食品及日用品中内分泌干扰物较为单一的特点，排放到环境中的内分泌干扰物质种类多样，浓度低且来源广，只针对某一种内分泌干扰物的分析手段，在日趋复杂的环境检测任务3无法起到很好作用。在已报道针对水体和土壤的检测方法中，多集中于单独检测一类内分泌干扰物质，工作重复量大，耗时长且成本较高，应用于实际工作可行性不高，且内分泌干扰物在环境中的浓度较低即可导致危害的特点，相对应的分析手段通常需要较低的检出限。因此，开发出能对多类环境激素物质同时进行高效分析的检测方案，能有效避免上述缺陷，有利于对检测的
10、规模化工作。综上所述，若能开发合适的前处理技术，配合高效检测手段，开发对多种环境类激素类物质进行同时检测将极大有助于检测效率的提高，使之适合于环境相关的监测工作。1、实验部分1.1 仪器及材料实验过程中所用到的仪器、试剂及标准物质如下表所示：表 1 实验仪器名称 型号规格 来源气相色谱质谱联用仪 7890AGC/5975CMSD 美国安捷伦科技有限公司超声波清洗器 KDOS 上海科超有限公司电子天平 十万分之一（0.01mg） 梅特勒-托利多公司漩涡混合仪 MS3 基本型 德国 IKA 公司固相提取装置 SPE-20 美国 Waters 公司氮吹仪 HGC-24A 天津恒奥科技发展有限公司硅胶
11、固相提取柱 1000mg/6mL 迪马科技有限公司C18 固相提取柱 500mg/6mL 迪马科技有限公司弗罗里硅土固相提取柱 1000mg/6mL 上海安谱实验科技股份有限公司表 2 实验试剂及标准物质名称 型号规格 品牌来源正己烷 色谱纯 TEDIA二氯甲烷 色谱纯 TEDIA丙酮 色谱纯 TEDIA己二酸二乙酯 纯品型，99.0% CNW己二酸二丁酯 纯品型，99.0% CNW己二酸二异丁酯 纯品型，99.0% CNW己二酸二（2- 乙基己基）酯 纯品型，99.5% Dr.Ehrenstorfer己二酸双（2- 丁氧乙基）酯 纯品型，97.0% CNW二（1-丁基戊烷）己二酸（内标） 纯
12、品型，98.% SIGMA-ALDRICH44-正庚基苯酚 纯品型，98.% CNW辛基酚 1000mg/L，1ml AccStandard壬基酚 纯品型，100% Dr.Ehrenstorfer邻苯二甲酸二正丙酯 纯品型，99.0% Dr.Ehrenstorfer邻苯二甲酸戊基异戊酯 纯品型，99.0% Dr.Ehrenstorfer邻苯二甲酸二异戊酯 纯品型，99.5% Dr.Ehrenstorfer邻苯二甲酸二庚酯 纯品型，99.0% Dr.Ehrenstorfer邻苯二甲酸二苄酯 纯品型，99.4% Dr.Ehrenstorfer邻苯二甲酸二癸酯 纯品型，99.0% AccStanda
13、rd邻苯二甲酸二苯酯 纯品型，99.5% Dr.Ehrenstorfer邻苯二甲酸酯混标（15 种） 1000mg/L ， 1ml AccStandard10 种多氯联苯（PCBs）混标 1000mg/L ， 1ml ANPEL1.2 样品制备与前处理将土壤样品放于常压下干燥，过 0.25mm 孔径筛去除石块、植物根茎和其它较大颗粒，经粉碎机研磨，过 0.12mm 孔径筛，保存于干燥器中待测。称取制备好的土壤样品 1.0g 于玻璃比色管中，加入 0.01mL 内标标准中间溶液和 10mL 50%丙酮+50% 正己烷混合溶剂（分两次加入） ，每次提取 20min，经离心后，合并提取液，用氮吹仪在
14、 40下吹至近干，准确加入 1.0mL 正己烷定容，涡漩作为待净化液。选用硅胶固相萃取柱（事先用 10mL 正己烷活化）进行净化，将净化液过柱，待自然流干后，用 10mL 洗脱液(90%二氯甲烷+10%丙酮）进行洗脱，收集洗脱液，用氮吹仪在 40下吹至近干，加入 1.0mL 正己烷定容，涡漩，过 0.22m 滤膜，上机测试。1.4 仪器工作条件1.5.1 色谱条件色谱柱：HP-5MS（30m*250m*0.25m)毛细管色谱柱；载气：氦气 ，纯度99.999%；进样口温度：280；柱温条件：60保持 1 分钟，以 10/min 的速率升温至 220，保持 1 分钟，以 5/min 的速率升温至
15、 280，保持 8 分钟；流速：1.0mL/min；进样方式：不分流；进样体积： 1L。1.5.2 质谱条件电离方式为EI ；离子源温度为 230；四级杆温度为 150；测定模式为全扫描（Fllscan）和选择离子监测（ SIM），质量扫描范围为：10550am，41种内分泌干扰物选择离子见表3。52 结果与讨论2.1内分泌干扰物的色谱分离根据查阅的文献资料，邻苯二甲酸酯类、己二酸酯类、烷基酚类和多氯联苯类内分泌干扰物均可在非极性毛细管色谱柱得到较好分离。由于本实验涉及检测组份数目较多，且种类不同，为了保证一次能够分离多种物质，需要对仪器的条件参数进行试验调整。实验中将配制的 41 种标准物质
16、混合溶液，通过 GC/MS 全扫描获得 41 种目标化合物的总离子流色谱图(图 1)及对应的质谱图，然后选择丰度高、干扰低的特征离子作为 SIM（选择离子监测）定量离子，同时选择丰度较高、干扰较低的 23 个特征离子作为定性离子，通过对定性离子丰度比例的分析实现对目标化合物的定性，按此方法 35min 内可完成 41 种目标化合物的分析测定。由图3可以看出，在此操作条件下，待测的41种物质能较好的分离，其分离效果较好，能够在不同保留时间下出峰，故该操作条件可行。图 3 标准物质全扫描总离子流色谱图 图 4 标准物质选择离子监测总离子流色谱图2.2提取方式的选择振荡提取、索氏提取等传统的提取方法
17、处理周期长、溶剂消耗量大。微波辅助提取、加速溶剂提取、超临界流体提取等仪器和技术成本相对较高。超声波提取法不仅能有效地将结构稳定的有机物从固体样品中提取出来，且具有效率高、仪器价格便宜、操作简单等优点。综合考虑，本研究选择超声波提取法提取土壤或底泥中这四类内分泌干扰物。62.3不同提取溶剂提取率的比较取3份相同土壤样品1.0g，加入10mg/L的40种内分泌干扰物标准中间溶液0.1ml，分别加入二氯甲烷、正己烷、50%丙酮+50%正己烷混合溶剂10mL对土壤样品进行超声提取30min，然后经离心，过滤膜上机测试。结果表明：二氯甲烷、50% 丙酮 +50%正己烷混合溶剂 提取效果较好；正己烷提取
18、效率除氯代联苯较好外，邻苯二甲酸酯、烷基酚和己二酸酯提取效率较差，回收率基本都在50%以下。研究发现，使用添加了二氯甲烷的正已烷丙酮混合溶剂体系对目标化合物提取效率较高，为测定土壤中内分泌干扰物的最佳提取溶剂。2.4 超声提取时间的选择 以二氯甲烷为提取溶剂时，考察 5、10、20、30min4 个不同的超声时间下样品提取率，确定最优提取时间。实验结果表明，随着超声时间的增加，目标化合物的提取率有所提高，在 20、30 分钟超声时间下提取效果较好，同时，由于 30 分钟的超声提取时间对目标化合物提取效率整体上有下降趋势，考虑目标化合物提取率及实验效率等因素，最终确定超声时间为 20 分钟。不
19、同 提 取 时 间 内 分 泌 干 扰 物 峰 面 积0500010000150002000025000DEA DMP PCB-1 DEP OP HP DIBA NP DBA DPRP峰面积5分 钟 10分 钟 20分 钟 30分 钟 不 同 提 取 时 间 内 分 泌 干 扰 物 峰 面 积010000200003000040000500006000070000PCB-2PCB-3DIBP DBP PCB-4DMEP DIPP BMPPPCB-5DnIPP峰面积5分 钟 10分 钟 20分 钟 30分 钟峰 面 积 图 5 不同提取时间下内分泌干扰物峰面积 图 6 不同提取时间下内分泌干扰物
20、峰面积不 同 提 取 时 间 内 分 泌 干 扰 物 峰 面 积05000100001500020000250003000035000DEEP DnPP PCB-6BBOEA DHXP BBP DEHA PCB-7 DBEP DCHP峰面积5分 钟 10分 钟 20分 钟 30分 钟 不 同 提 取 时 间 内 分 泌 干 扰 物 峰 面 积0100200300400500600700800900DHP DEHP邻 苯 二 甲酸 二 苯 酯 DNOP PCB-8邻 苯 二 甲酸 二 苄 酯 PCB-9PCB-10 DNP DP峰面积5分 钟 10分 钟 20分 钟 30分 钟图 7 不同提取时
21、间下内分泌干扰物峰面积图 8 不同提取时间下内分泌干扰物峰面积2.5 固相提取柱净化效果及洗脱溶剂比较对硅胶柱、C 18 柱和弗罗里硅土柱(Florisil 小柱)进行洗脱对比实验。实验过7程称取相同阴性土壤样品 1g，并加入 10mg/L 的 40 种混合标准溶液 0.1ml，按土壤样品前处理步骤进行，得到待净化液，按照正交实验步骤，分别对硅胶柱、C18 柱和弗罗里硅土柱三种固相萃取柱净化效果，以及正己烷、二氯甲烷、二氯甲烷丙酮（91，V/V）三种洗脱溶剂洗脱效果进行正交实验分析。 结果显示无论选用哪种提取柱时，三种洗脱溶剂的总体效果皆为二氯甲烷丙酮（91，V/V）最佳。当用 二氯甲烷 丙酮
22、（91，V/V）混合溶液作为洗脱溶剂，比较硅胶柱、C 18 柱和弗罗里硅土柱的净化效果，其中硅胶柱的回收率较高，基质干扰较少，净化效果最好，因此本实验采用硅胶柱净化。2.6标准曲线及检出限分别对 40 种内分泌干扰物标准工作系列溶液（0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.0，2.0 mg/L）进行测定，通过内标法，以 40 种内分泌干扰物定量离子与内标物二（1-丁基戊烷）己二酸定量离子峰面积比 y 对其浓度比 x 进行线性回归。结果显示，在 0.012.0 mg/L 浓度范围内，所得峰面积比与浓度比的线性关系良好，线性回归方程和相关系数（R 2）如表10 所示。称取阴
23、性空白样品，加入 40 种内分泌干扰物标准工作溶液，上机测试得出信噪比，以 3 倍信噪比（S/N=3）得出该方法检出限，结果如表 10 所示。表 10 40 种内分泌干扰物线性回归方程及相关系数（R 2）序号 物质 线性回归方程 R2 值 检出限，g/kg1 DEA y=0.5825x-0.009325 0.9997 1.832 DMP y=1.632x+0.2145 0.9989 0.683 PCB-1 y=1.490x+0.3954 0.9972 0.674 DEP y=1.647x+0.1993 0.9995 0.035 OP y=1.813x-0.3841 0.9996 0.836 H
24、P y=2.832x-1.003 0.9987 0.517 DIBA y=0.9444x-0.02495 0.9996 1.828 NP y=1.359x-0.2891 0.9995 1.799 DBA y=0.4043x-0.08275 0.9996 1.0510 DPRP y=2.477x+0.1711 0.9991 0.4111 PCB-2 y=0.5046x+0.1403 0.9971 0.4912 PCB-3 y=0.6314x+0.1311 0.9980 0.4413 DIBP y=2.378x-0.01695 0.9998 0.0914 DBP y=2.713x-0.1498 0
25、.9999 4.7615 PCB-4 y=0.4500x+0.08006 0.9988 2.00816 DMEP y=1.203x-0.2568 0.9996 1.4117 DIPP y=1.334x-0.2951 0.9996 1.1418 BMPP y=1.178x-0.1229 0.9999 1.6719 PCB-5 y=0.4115x+0.08081 0.9979 0.8320 DnIPP y=2.771x-0.5730 0.9992 1.8221 DEEP y=0.9316x-0.2909 0.9993 5.8822 DnPP y=3.159x-0.5740 0.9998 0.952
26、3 PCB-6 y=0.3690x+0.1024 0.9974 0.9624 BBOEA y=0.4641x-0.1992 0.9977 1.5225 DHXP y=2.670x-0.9802 0.9985 0.5626 BBP y=1.140x-0.1608 0.9998 4.5527 DEHA y=1.116x-0.1153 0.9999 5.0028 PCB-7 y=0.3007x-0.04825 0.9986 1.7929 DBEP y=0.4900x-0.1731 0.9984 7.1430 DCHP y=1.939x-0.2631 0.9998 1.6731 DHP y=9.642
27、x-4.264 0.9967 1.0432 DEHP y=5.640x-0.8482 0.9998 0.6033 DPhP y=1.126x-0.03255 0.9995 2.7834 DNOP y=2.379x-1.320 0.9945 1.9635 PCB-8 y=0.2646x+0.01065 0.9996 2.0036 邻苯二甲酸二苄酯 y=1.104x-0.5321 0.9967 8.3337 PCB-9 y=0.2220x-0.04110 0.9982 7.6938 PCB-10 y=0.2521x+0.03132 0.9990 1.8239 DNP y=1.911x-1.011
28、0.9945 3.5740 DDP y=0.9371x-5.005 0.9901 4.002.7方法回收率及精密度试验称取 1g 空白样品于 10mL 比色管中，按低、中、高三个水平分别加入1mg/L 的 40 种内分泌干扰物混合标准溶液 0.02mL，0.1mL，1.0mL，每个水平6 个平行，然后按照样品前处理步骤进行实验，经上机得出对应的回收率。表 11 精密度和回收率试验结果（n=6）样品添加水平0.02mg/kg 0.1mg/kg 1.0mg/kg编号 化合物名称回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%1 DEA 85.94 6.20 81.65 7.8
29、9 87.07 5.082 DMP 81.48 5.89 84.02 9.37 85.74 4.603 PCB-1 86.30 6.70 87.31 6.80 83.49 3.584 DEP 81.73 8.71 88.46 4.53 88.45 5.465 OP 82.10 5.18 80.37 2.73 84.26 10.076 HP 82.09 4.74 83.53 5.08 95.13 12.0997 DIBA 85.10 10.89 83.71 6.95 87.44 9.688 NP 86.26 7.07 89.18 5.08 95.74 10.049 DBA 82.57 6.56
30、86.14 3.75 91.07 8.9710 DPRP 80.83 4.21 82.40 2.73 87.25 5.6711 PCB-2 80.71 6.85 81.21 7.73 80.59 11.0812 PCB-3 80.23 5.44 85.13 8.44 84.34 5.4913 DIBP 87.65 7.48 93.57 9.37 90.81 7.2214 DBP 89.30 10.68 101.17 7.89 94.66 9.6915 PCB-4 86.38 7.16 90.15 4.53 86.34 7.5616 DMEP 90.86 8.86 97.35 5.94 93.2
31、6 9.3117 DIPP 95.68 10.95 101.67 3.75 96.87 11.2518 BMPP 85.66 9.25 98.62 4.53 96.92 13.9519 PCB-5 88.56 7.00 90.47 5.08 90.10 4.1720 DnIPP 95.12 8.51 102.68 8.44 96.79 10.9521 DEEP 88.12 8.23 94.37 11.72 90.32 7.9322 DnPP 83.78 10.68 98.98 12.50 93.71 9.1423 PCB-6 91.24 10.15 100.53 2.73 88.22 8.79
32、24 BBOEA 89.64 6.64 103.53 4.37 98.00 13.0225 DHXP 92.57 11.61 105.79 5.31 99.82 13.1026 BBP 92.60 9.73 98.00 5.62 94.79 9.2627 DEHA 92.16 11.68 107.92 4.61 100.73 13.7928 PCB-7 91.47 9.10 98.17 3.75 98.64 12.9629 DBEP 101.35 11.65 108.23 4.84 99.58 12.2830 DCHP 86.71 4.61 111.09 2.97 96.24 10.5231
33、DHP 92.41 11.98 107.09 7.73 99.42 12.5232 DEHP 90.20 9.95 105.26 10.47 94.01 9.3033 DPhP 89.86 8.71 103.41 6.09 97.07 18.5234 DNOP 102.22 12.51 95.53 13.28 95.92 11.3435 PCB-8 90.94 8.28 101.30 7.81 90.61 14.6136 邻苯二甲酸二苄酯 100.50 8.78 95.03 7.65 93.63 13.1737 PCB-9 81.94 2.89 113.34 5.31 101.06 13.46
34、38 PCB-10 87.24 8.59 87.55 4.45 90.38 6.6339 DNP 85.39 6.94 81.87 3.83 98.89 13.1340 DDP 95.13 10.92 91.46 5.31 91.46 7.912.8实际样品分析利用本实验室建立的方法，将采集来的 30 份土壤样品进行了检测，根据保留时间和离子比率定性，外标法定量，结果表明，在所选取的土样中，邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP），邻苯二甲酸二丁酯（DBP）与邻苯二甲酸二（2-乙基）10己酯（DEHP）等常见的邻苯二甲酸酯类均有检出。阳性样品的色谱图如图 9所示。表12 样品检测结果检出的内分泌干扰物，
35、 mg/kg样品DMP DEP DIBP DBP DEHA DEHP NPS1-1 0.03 2.60 0.30 1.30S1-2 0.01 1.70 0.11 0.61S1-3 0.05 2.10 0.18 0.65S2-1 0.02 4.30 1.20 2.40S2-2 0.02 4.30 0.25 1.60S2-3 0.01 3.40 0.18 0.36S3-1 0.02 3.70 0.14 2.70 0.76S3-2 0.03 1.30 0.11 0.01 0.57S3-3 0.01 6.70 0.23 0.02 0.31S4-1 0.10 0.02 4.60 0.84 6.20S4-
36、2 0.01 4.10 0.14 0.79S4-3 0.01 3.60 0.13 0.17S5-1 0.02 0.02 1.10 0.24 0.22S5-2 0.06 4.50 0.25 0.22S5-3 0.02 0.02 3.40 0.17 0.37S6-1 2.10 0.13 0.19 0.68S6-2 0.01 2.20 0.21 0.20 0.51S6-3 0.01 0.03 1.80 0.10 0.01 0.61S7-1 0.01 0.04 2.50 0.16 0.51 0.35S7-2 0.01 0.05 1.40 0.12 0.16 0.51S7-3 0.01 0.03 2.9
37、0 0.23 0.34 0.44S8-1 0.01 0.03 0.98 0.15 0.46 0.59S8-2 0.01 0.01 1.60 0.11 0.16 0.34S8-3 0.01 0.01 2.10 0.14 0.32 0.43S9-1 0.01 0.03 1.80 0.17 0.15 0.49S9-2 0.01 0.03 3.00 0.18 0.35 0.43S9-3 0.75 0.04 0.08 0.31S10-1 0.01 0.02 3.50 0.11 0.22 0.67S10-2 0.01 2.70 0.10 0.10 0.4S10-3 0.01 0.04 3.50 0.38 0.36 0.48
