1、1裂殖壶菌细胞破壁工艺的研究何文胜 1, 2*，王 灿 2，杨诗颖 2（1. 福建生物工程职业技术学院，福建 福州 350002；2. 福建师范大学 工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心 生命科学学院，福建 福州 350117）摘要：裂殖壶菌是目前用于商业化生产 DHA 的高产菌株之一，由于 DHA 属于胞内油脂，因此对其进行充分破壁是工业化提取 DHA 的关键工序。研究酸热法、碱热法、超声波法以及酶法对裂殖壶菌细胞破碎的影响，考察不同破壁方法提取得到的油脂含量，结果表明酶法是最优破壁方法。继而探讨不同单一酶的油脂提取量，并将破碎效果最好的单一酶（碱性蛋白酶）和多种复合酶进行比较，确定最
2、佳用酶为碱性蛋白酶。为进一步完善酶法破碎裂殖壶菌细胞的效果以提高油脂得率，对碱性蛋白酶酶解的温度、pH、时间以及酶用量等条件进行优化。 正交试验结果表明，碱性蛋白酶最佳酶解条件为酶用量 2%，温度55 ， pH 10，酶解时间 2 h。在此优化条件下，裂殖壶菌 Schizochytrium sp. FJU-512 的 油脂提取量达到0.4586 g/g。关键词：裂殖壶菌；提取；油脂；酶法破碎中图分类号： TQ 920.6 文献标志码：A DHA（Docosahexaenoic acid，二十二碳六烯酸）是一种重要的 -3 系列长链多不饱和脂肪酸，在人类大脑皮层、视网膜、睾丸以及精子中含量很高，
3、是大脑结构脂肪酸不可或缺的成分之一 1-2，具有增强记忆力、提高智力、降低血压和血脂、预防老年痴呆 3-4、延缓衰老 5等功能，是一种重要的功能保健因子。裂殖壶菌 Schizochytrium 是一类单细胞海洋真菌，是目前商业化生产 DHA 的菌株之一，其安全性已经得到美国食品和药品部（FDA ）的认可，可广泛应用于婴幼儿配方食品、孕期和哺乳期妇女食品及功能性食品 6。裂殖壶菌 Schizochytrium sp. FJU-512，是本实验室分离获得的一株具独立知识产权的 DHA 高产菌株 7。该菌株生长速度较快，脂肪酸组成简单，DHA 含量高且易纯化 8，可作为 DHA 油脂相关研究的优势菌
4、株。DHA 主要以甘油酯的形式存在裂殖壶菌胞体内，为了获取胞体内的油脂，首先需进行裂殖壶菌细胞破碎。不同的细胞破碎方法直接影响 DHA 的产量、质量和生产成本，因此选取一种合适的细胞破碎工艺对工业化生产 DHA 尤为重要 9-10。目前在 DHA 的实际生产中，主要采用高压匀质等技术进收稿日期：2015-11-10 录用日期：2016-02-23基金项目：福建省自然科学基金重大项目（2011H6007）；福建省自然科学基金项目（2009J05057）；福建省科技重大专项（2010NZ0001-4）；福建省发改委产业化专项（闽财指2010 358 号）；福建省科技创新平台项目（2014Y2008
5、）*通信作者：2行细胞破碎以释放胞内油脂，但高压匀质单次破壁效果差，必须进行多次重复操作，容易造成匀质机损耗严重，影响大规模连续作业 11。本课题组选取多种不同的细胞破碎方法用于破碎裂殖壶菌胞体，通过对比油脂提取量，并权衡实际工业生产的可操作性，确定裂殖壶菌的最适破壁方法，优化破壁工艺条件，以期为 DHA 的工业化生产提供一定的技术支持。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种裂殖壶菌 Schizochytrium sp. FJU-512 菌株由本课题组保藏，菌粉来源于 15 L 发酵罐发酵后收取，6 000 r/min 离心取菌体沉淀，-80 冻干菌体即得菌粉。1.1.2 试剂氢氧化钠（A
6、R） ，碳酸钠（AR） ，盐酸（AR） ，乙醇（AR） ，正己烷（AR）：国药集团化学试剂有限公司；碱性蛋白酶：Ruibio，比酶活200 U/mg；中性蛋白酶：Ruibio ，比酶活100 U/mg ；纤维素酶：Ruibio，比酶活30 U/mg； -葡聚糖酶：Ruibio ，比酶活3 000 U/mg。1.1.3 仪器 高压灭菌锅：上海博迅实业有限公司；双层全控温摇床：上海智诚分析仪器有限公司；高速台式冷冻离心机：Beckman Coulter；紫外分光光度计：Amersham Bioscience；循环水多用真空泵：郑州长城工贸有限公司；恒温培养箱：上海智诚分析仪器有限公司；超级恒温水槽
7、：上海一恒科技有限公司；冻干机：美国 LABCONCO 公司 FreeZone 系列冷冻干燥机。1.2 方法1.2.1 细胞破碎方法1) 酸热法：取 1 g 裂殖壶菌菌粉于 10 mL 离心管，加入 3 mL 30%的浓盐酸，重悬菌体，80 恒温水浴 1 h。2) 碱热法：取 1 g 裂殖壶菌菌粉于 10 mL 离心管，加入 3 mL pH 10 的复合碱液（氢氧化钠:碳酸钠=10:1） ，80 恒温水浴 2 h。3) 超声波法：取 1 g 裂殖壶菌菌粉于 10 mL 离心管，加入 3 mL 单蒸水重悬菌体，置于 400 Hz 下超声 4 s，间隔 4 s，持续 1 h。4) 酶法破碎：取 1
8、 g 裂殖壶菌菌粉于 10 mL 离心管，加入 3 mL pH 已调为 10 单蒸水重悬菌体，酶（碱性蛋白酶）用量 2 %，50 恒温水浴酶解 2 h。1.2.2 油脂提取方法3破壁待冷却后加 0.75 mL 无水乙醇与 2 mL 正己烷，充分摇匀，1200 r/min 离心 2 min，萃取油脂，取上清于已知重量的螺口管中。重复上述操作 3 次，充分萃取油脂。将螺口瓶放置干燥器中真空过夜抽干即得油脂，再次称重，所得重量减去螺口管重即为油脂重量。2 结果2.1 不同破碎方法对油脂提取的影响以裂殖壶菌 Schizochytrium sp. FJU-512 菌粉为材料，采用 4 种不同的细胞破碎方
9、法（酸热法、碱热法、超声波法、酶法）对其进行破碎，各种破碎方法获得的油脂量如图 1 所示，其中酶法和碱热法破碎细胞效果最好，油脂量分别达到 0.4535 g/g 和 0.4466 g/g，其次为酸热法，而超声波法破壁效果相对较差。酶法作用条件温和、高效、低能耗，且能确保内含物成分破坏最小。另外，目前工业酶价格低廉且易得，因此确定裂殖壶菌最佳破碎方法为酶法破碎。图 1 各种不同的细胞破碎方法获得的总油脂及 DHA 产量Fig 1 Effects of different cell disruption methods on total lipid and DHA yields碱热法破碎主要是利用
10、强碱对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和蛋白质）的作用，改变其空间结构，使原来结构紧密的细胞壁变得疏松，再经沸水浴处理破坏细胞壁结构，从而释放胞内油脂 12。酶溶法是一种研究较广的方法，利用酶反应分解破坏细胞壁上特殊的键而达到破碎并释放油脂的目的 13，即利用能溶解细胞壁的酶，如蛋白酶，纤维素酶等，处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或者完全破坏之后，进而破坏细胞膜结构，增加胞内外的通透性，降低渗透压，从而使细胞裂解。相比碱热法，酶法提取条件温和、能量需求低，同时具有对总脂和 DHA 破坏小，得率高的优点，所以酶法提取油脂是首选的方法。42.2 不同种类酶对油脂提取的影响选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、纤
11、维素酶和 -葡聚糖酶作为破碎试验用酶，分别考察其对裂殖壶菌细胞破碎的效果，各酶用量均为菌体干重 2 %，且均在最适条件下酶解 2 h。不同种类酶获取的油脂量如图 2 所示。图 2 不同种类酶处理获取的油脂量Fig 2 Effects of different enzymes on lipid extraction如图 2 所示，碱性蛋白酶作用效果最好，用其破碎裂殖壶菌所得的油脂量明显最高，其他几种酶的破碎效果依次为中性蛋白酶纤维素酶- 葡聚糖酶。碱性蛋白酶的作用位点在羧基侧富含芳香氨基酸（如酪氨酸和苯丙氨酸）或者疏水性氨基酸（丙氨酸和亮氨酸等）构成的肽键 12, 13，所以碱性蛋白酶比中性蛋白
12、酶和酸性蛋白酶的水解能力更强，同时还具有水解酯键、酰胺键和转酯化甚至转肽的功能。碱性蛋白酶的这些特有性质使其可以降解复杂的大分子蛋白质结构进而变成低分子量的小分子肽链或者氨基酸，其另一种功能可能与部分破坏蛋白质结构有关，从而使蛋白组分变得易于吸收或洗去，目前工业上应用最广的也是碱性蛋白酶。因此本研究选取碱性蛋白酶作为实验用酶。2.3 碱性蛋白酶酶解条件的单因素实验2.3.1 酶解温度的影响酶的化学成分为蛋白质，温度对其生物催化活性至关重要，根据碱性蛋白酶的性质，选取 4565 温度区间考察。称取 1 g 裂殖壶菌菌粉于 10 mL 离心管，加入 3 mL pH 已调为 10 单蒸水重悬菌体，酶
13、用量 2 %， 55 恒温水浴酶解 2 h。考察酶解温度对油脂产量的影响，结果如下图 3 所示。5图 3 酶解温度对油脂产量的影响Fig 3 Effects of enzymatic temperature on total lipid extraction yield由图 3 所知：随着温度的升高，裂殖壶菌油脂提取量先升后降，在 55 时油脂提取量最多，则可知在此温度下，酶的催化活性最高，细胞破碎效果最好，而当温度超过 55 时提油量下降，可能是因为温度过高部分酶已经开始失活。因此选取正交实验温度为 5060 。2.3.2 酶解 pH 的影响酶只有在适宜的温度下才能发挥催化效果，同样，适宜的
14、 pH 条件对酶的影响也是巨大的，pH 的偏移会导致酶活性部位结构的改变而影响其酶活。根据碱性蛋白酶的最适 pH 范围，选取 pH8.510.5 区间进行考察，酶解温度为 55 ，裂殖壶菌菌粉量、酶解时间以及酶用量同上，考察酶解 pH 对油脂产量的影响，结果如下图 4 所示。图 4 酶解 pH 对油脂产量的影响Fig 4 Effects of enzymatic pH on lipid extraction yield6由图 4 所知：裂殖壶菌油脂提取量随着 pH 升高先增加，在 pH 为 9.5 时达到最高，随后开始降低，可知该酶的最适 pH 为 9.5， pH 偏高或偏低都不易使酶发挥好的
15、催化效果。因此选取正交实验的 pH 范围为 9.010.0。2.3.3 酶解时间的影响通常而言，酶解时间越长，细胞破碎效果越好，收获的油脂量也会越多，实际上，酶解反应时间过长也会导致胞内其他共溶物质的逐步渗出，从而会增加后期 DHA 分离的难度，同时过长的时间在实际生产中也需要相应能耗成本的增加。因此选取 1.53.5 h 时间区域进行考察，酶解温度为 55 ，酶解 pH 为9.5，裂殖壶菌菌粉量和酶用量同上，考察酶解时间对油脂产量的影响，结果如下图 5 所示。图 5 酶解时间对油脂产量的影响Fig 5 Effects of enzymatic time on lipid extraction
16、 yield由图 5 所知：碱性蛋白酶在最佳酶解温度和 pH 条件下，油脂提取量得到一定的提高，且相对稳定，在酶解 2 h 和 3.5 h 后油脂量达到两个高峰，基于后期 DHA 分离难度和能耗成本考虑，选取正交实验酶解时间为 1.52.5 h。2.3.4 酶用量的影响酶用量的多少与底物的浓度存在一定的联系，偏少时细胞破碎不彻底，偏多又可能造成产物抑制而影响酶的活性，因此选择适宜的酶量尤显重要，本实验选取裂殖壶菌菌粉量的 13 %范围，在温度为 55 ，pH 为 9.5 的条件下酶解 2h，考察酶用量对裂殖壶菌油脂提取量的影响，结果如下图 6 所示。7Fig 6 Effects of enzy
17、me concentration on lipid extraction yield图 6 酶用量对裂殖壶菌油脂提取量的影响由图 6 所知：随着酶用量的增加，提油量逐渐增加，在 2 %的酶用量下，总油脂得率最大，随后酶用量再增加，油脂量逐渐减少。由上可知，在破碎裂殖壶菌细胞时，碱性蛋白酶的最佳酶用量为 2 %，此时，底物与酶能最有效的结合，破碎效果最好，因此选取正交实验酶用量为 1.52.5 %。2.4 酶解条件的正交实验以碱性蛋白酶为实验用酶，油脂含量为实验指标，设计4因素3水平 L9(34)正交实验（表1） ，对酶解的温度、pH、时间、酶用量进行优化，以确定最佳酶解条件。结果见表2，方差分
18、析结果见表3。表 1 正交试验设计表Tab. 1 Factors and levels of the orthogonal test因素温度（） pH 时间（h） 酶用量（%）水平(A) (B) (C) (D)1 50 9.0 1.5 1.52 55 9.5 2 23 60 10.0 2.5 2.5表 2 正交试验结果Tab. 2 Result of the orthogonal test编号 A B C D 油脂含量（g）1 1 1 1 1 0.4232 2 1 2 2 2 0.4080 3 1 3 3 3 0.4326 4 2 1 2 3 0.4399 5 2 2 3 1 0.4286 6
19、 2 3 1 2 0.4369 87 3 1 3 2 0.4299 8 3 2 1 3 0.4169 9 3 3 2 1 0.4379 k1 1.2638 1.293 1.277 1.2897k2 1.3054 1.2535 1.2958 1.2948k3 1.2847 1.3074 1.2811 1.2894R 0.0416 0.0539 0.0141 0.0149表 3 方差分析结果Tab. 3 Variance analysis of the orthogonal test来源 平方和 自由度 均方 F 值 PrF 显著性A 0.00055401 2 0.00027700 5.81 0.
20、0113 显著B 0.00098941 2 0.00049470 10.38 0.0010 极显著C 0.00000307 2 0.00000153 0.03 0.0968 不显著D 0.00002925 2 0.00001463 0.31 0.0739 不显著模型 0.00157574 8 0.00019697 4.13 0.0059 极显著误差 0.00085798 18 0.00004767总和 0.00243371 26注：R 2=0.92699由表3方差分析结果可知，因素A （温度） 、因素B（pH） 、因素C（时间） 、因素D（酶用量）对结果影响的显著程度依次为BADC，综合各个因
21、素的K 值比较可得，此次实验理论最优酶解条件为A2B3C2D2，即酶用量为2 %，温度55 ，pH10 ，酶解时间 2 h。2.5 酶解条件的重复验证试验为了验证正交实验的准确性和有效性，将正交实验获得的最佳酶解破壁条件进行重复实验，通过3组平行实验（油脂产量分别为0.4591，0.4585和0.4583 g/g） ，得出裂殖壶菌Schizochytrium sp. FJU-512平均油脂量为0.4586 g/g。使用优化的酶解破碎裂殖壶菌细胞的方法，油脂平均收率分别比酸热法提高了6.52 %，比碱热法提高了2.62 %，比超声破碎法提高了11.25 %。3 结论裂殖壶菌细胞破碎的方法多样，具
22、有各自的特点和优点，且其工艺也日趋成熟。但仍然存在诸如能耗高、耗时长、反应条件剧烈造成部分DHA氧化等问题。为解决此类问题，以裂殖壶菌Schizochytrium sp. FJU-512为材料，对 4种细胞破碎方法提取油脂的效果进行了比较研究。其中酶法和碱热法提取的油脂含量均较高，且操作简单；酸热法和超声法提取的油脂含量次高。就工业化而言，超声法对设备要求较高，而碱热法和酸热法若大规模应用则更为耗能。综合上述条件，选用酶法作为裂殖壶菌破碎的研究方法。进一步对酶法破壁工艺进行优化。工业上最常用的破壁蛋白酶是碱性蛋白酶，因其通常利用胞外分9泌表达的方法来生产，容易获得，且碱性蛋白酶比中性蛋白酶和酸
23、性蛋白酶的水解能力更强，同时还具有水解酯键、酰胺键和专转酯化甚至转肽的功能 13。本文前期工作也发现碱性蛋白酶作用效果最好，故此我们确定实验最佳用酶为单一酶（碱性蛋白酶） 。设计4因素3水平L 9(34)正交实验，确定碱性蛋白酶酶解的最适温度、pH、时间、酶用量等条件，分别是酶用量2 %，温度55 ，pH10，酶解时间2 h。通过重复性验证实验得到裂殖壶菌S chizochytrium sp. FJU-512的 油脂平均提取量为0.4586 g/g，证实了最佳酶解条件的优越性。随着工业化设备的配套和生产工艺的发展，酶法作为一种高效、经济的油脂提取方法将为油脂的工业生产打开一个新局面，本研究也为
24、后续有针对性地下游分离纯化DHA的工艺奠定基础。参考文献：1 张明亮, 江贤章, 余清梅, 等. 高密度流加放大培养 Schizochytrium sp. FJU-512 生产DHA J. 药物生物技术, 2013, 20(1): 34-38.2 Simopoulos A P. Omega-3-Fatty-Acids in health and disease and in growth and developmentJ. American Journal of Clinical Nutrition, 1991, 54(3): 438-463.3 Meadus W J, Duff P, Rol
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26、lamusJ. The American Journal of Clinical Nutrition, 2009, 89(3):985S-990S.5 Undurti N, Das M D. Metabolic Syndrome Pathophysiology: The Role of Essential Fatty AcidsM. USA: Wiley-Blackwell, 2010: 201.6 林杰. 裂殖壶菌粉碱热法破壁提取其胞内油脂J. 广州化工 , 2012, 40(18): 54-56.7 黄建忠 , 江贤章. DHA 高产菌 Schizochytrium spFJU-512 的
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30、eering, Fuzhou, Fujian 350002, China,2. School of Life Science, National and Local Joint Engineering Research Center of Industrial Microbial Fermentation Technology，Fujian Normal University，Fuzhou 350117，China )Abstract: As one of the high-yield strains for DHA, Schizochytrium limacinum is currently
31、 used in commercial production. Cell disruption was an important process in the industrialized extraction for DHA production. In this study, the effects of different cell disruption methods, such as acid-heating extraction, base-heating extraction, ultrasonic extraction and enzymatic extraction on t
32、he extraction of single cell lipid of Schizochytrium sp. FJU-512 were demonstrated. Results indicated that enzymatic extraction was the more effective than the other methods. After this, the influence of different kinds of single enzyme on oil extraction was examined. It is found that the alkaline p
33、rotease was the most effective enzyme according to the results of crushing. To further improve the lipid yield, orthogonal test was applied to optimize the enzymatic hydrolysis conditions. The optimal condition to achieve the highest cell disruption rate was as follow: 0.2% of enzyme, temperature 55 , pH10, hydrolysis time 2 h. Under these conditions, the oil extraction amount reached 0.4586 g/g.Key words: Schizochytrium sp.; extraction; lipid; enzymatic disruption
