1、实验一、微藻原生质体的分离 实验目的1. 了解微藻原生质体分离的原理、方法与技术；2. 熟练、掌握原生质体分离的基本操作过程。 实验原理 根据藻类细胞脱壁程度的不同， Adamich将脱壁后的藻细胞定义为原生质体（ protoplast）和原生质球（ spheroplast）。原生质体是指任何基因型的藻细胞其质膜外的细胞壁和包被层被全部除去而保持其余细胞组分的部分；原生质球是任何基因型的藻细胞其细胞壁被全部或部分除去，仍保留质膜外包被层的含全部细胞内组分的部分。 海洋微藻因其细胞壁组成的明显差异，原生质体的分离方法很多，例如蓝绿藻的细胞壁含有粘肽，因而可以用溶菌酶处理获得蓝绿藻细胞的原生质体。
2、绿藻的细胞壁主要成分是纤维素，所以可以用纤维素酶处理而获得原生质体或原生质球。硅藻和甲藻因其特殊的细胞壁组成和结构，可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶液处理而达到分离原生质体的目的。红藻和褐藻则可用多糖酶消化细胞壁成分来制备原生质体。尽管有这样多的方法，但目前普遍采用的方法是酶解的方法。 仪器与试剂 1、 仪器 恒温水浴； 低速离心机； 冷冻离心机； 离心管 40-50ml; 三角烧瓶； 显微镜，荧光显微镜。2、试剂与酶 酶：纤维素酶（ Onozuka R-10） ,离析酶； 浸透压调节剂：甘露醇、山梨醇和 Nacl； 密度勾配剂Ficoll和蔗糖。 实验步骤1、藻株的培养；2、原生质
3、体的分离；（ 1）取对数期的培养藻细胞（浓度为 5107细胞/ml） 10ml离心沉淀（ 1000g,5min,室温）。（ 2）用加入 0.85mol/LNaCl的 MBM液洗沉淀的藻细胞一次（ 1000g,5min）。在相同的 MBM液中加入 1% 纤维素酶和 0.5% 的离析酶。将洗好沉淀的细胞在 10ml上述加酶的培养液中悬浮。（ 3）在振荡器上缓慢振荡（ 20-30次 /min）细胞悬浮液， 30 保温， 1000-2000lx光照。（ 4）在定时取出 1ml处理样品，离心分离（1000g,5min），用 MBM液（含 0.6mol/l山梨醇）洗涤一次，离心沉淀后，用 MBM液（含0.
4、6mol/l山梨醇）重新悬浮。（ 5）取 0.1ml上述悬浮液再悬浮到 0.9ml蒸馏水中，显微镜下观察悬浮液中的细胞。原生质体化的细胞膨胀变大、破裂，可见内容物漏出。（ 6） 80% 以上细胞原生质体化后（ 1-2h） ,将细胞悬浮液置于离心管中配制好的 Ficoll不连续密度离心介质（ 10%-25% ）的顶部， 10000r/min离心 30min。（ 7）在 15%-20% 界面处回收原生质体，用 MBM（含 0.6mol/l山梨醇）液洗涤原生质体。 作 业1、影响微藻原生质体分离效果的因素有哪些？2、原生质体和原生质体球之间有何差异？实验二、原生质体培养 实验目的 1、学习掌握原生质体培养培养基的种类以及配制方法；2、熟练掌握原生质体培养的基本过程与技术要领。
