1、HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_1本指南由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心艾滋病参比实验室组织有关专家撰写，由中国疾病预防控制中心批准执行。编写主持人：蒋岩编写人员： 潘品良 蒋岩 李敬云 钟平 尚红 李太生审核咨询专家及技术人员：邵一鸣 康来仪 朱效科 王佑春 汪宁 朱红 郭志宏 季阳 刘海林 肖瑶 邱茂锋 马春涛编写单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心参编单位：中国人民解放军军事医学科学院上海市疾病预防控制中心中国医科大学北京协和医院技术顾问：Mike Ussery, Hao Zhang美国国立卫生研究院 过敏及传染病研究所James W. Bremer美国
2、Rush 大学医学中心 VQA 实验室Trever Peter克林顿基金中国艾滋病防治项目实验室专家Donald J. Brambilla美国华盛顿大学新英格兰研究所Francis F. Mandy加拿大公共卫生局疾病预防控制中心国家免疫学实验室HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_2前 言随着 HIV-1 病毒载量检测在艾滋病临床辅助诊断和抗病毒治疗监测以及艾滋病科研工作中的广泛应用，我国开展该项检测工作的实验室日益增多。自 1997 年艾滋病实验室首次引进 HIV-1 病毒载量检测技术，截至 2007 年底，全国已经配备了近 120 台 HIV-1 病毒载量检测仪，覆盖了疾控、医院、检疫
3、、军队等系统。目前，虽然许多实验室已经将病毒载量检测纳入艾滋病相关辅助诊断和治疗监测工作，但大多数实验室开展工作的时间较短，经验不足，因此，急需加强该领域的培训和质量控制工作，以保证检测结果的准确性和可靠性。为了加强质控和保证检测质量，并得到国际上的认可，艾滋病参比实验室 2004 年开始参加美国 NIH 组织的 HIV-1 病毒载量检测能力验证工作。在通过考核和积累经验的基础上，2005 年启动了国内 HIV-1 病毒载量检测能力验证工作。在积极组织实验室能力验证的同时，艾滋病参比实验室也对实验室技术人员进行培训，积极开展室内质控。这些工作对提高HIV-1 病毒载量的检测技术，保证质量起到了
4、重要作用。为了进一步规范艾滋病实验室HIV-1 病毒载量检测，建立标准化质量控制程序，准确开展各项检测及质量控制工作，特制定本指南。本指南是根据各种 HIV-1 病毒载量检测方法的技术要求，结合现行的国内外相关技术规范而制定。本指南针对 HIV-1 病毒载量检测的实验室设置、样品管理、检测技术、质量控制、生物安全等方面提出指导。本指南自 2006 年初正式开始编写，性病艾滋病预防控制中心多次组织了有国内外专家参加的指南编写专项技术咨询会，与会专家对指南提出了很多建设性意见和建议，美国NIH 病毒载量检测质量保证实验室专家多次对指南进行认真的审阅和具体指导。指南编写过程中，也认真听取了实验室一线
5、检测人员的具体需求和建议，并补充了大量的实验数据，包括 HIV-1 病毒载量检测值的稳定性、冻融影响实验与不同检测方法之间比较的实验数据等。在此基础上，经过多次修订、补充和审定，于 2007 年 11 月完成HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南的最后定稿。由于国内外还没有可作为参考的 HIV-1 病毒载量检测及质量控制的相关指南，因此本指南主要提出一些原则上的参考建议，其中定有不妥之处，希望广大同仁提出意见，以便不断完善。致 谢在本指南的编写过程中，世界卫生组织、克林顿基金中国艾滋病防治项目和美国 NIH等国际组织与机构给予了大力支持，全国 HIV-1 病毒载量检测实验室一线操作人员提出了许
6、多建设性的意见和具体需求，艾滋病参比实验室工作人员毛玮、陶晓霞进行了大量的补充实验和文字编辑工作，才保证本指南的编写顺利完成，在此一并向他们表示真诚的感谢。中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心主任吴尊友研究员在本指南编写过程中提出了重要的修改意见，在此特别致谢。HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_3HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南（2007 版）目录第一章 总则第二章 实验室设置第三章 样品的采集、处理、保存、运输第四章 常用 HIV-1 病毒载量检测方法简介第五章 室内质量控制第六章 外部质量控制第七章 实验室生物安全附表 1 常见问题分析和处理附表 2 HIV-1 病毒载量
7、检测样品送检及接收单附表 3 HIV-1 病毒载量检测能力验证样品接收专用单附表 4 HIV-1 病毒载量检测报告单附表 5 HIV-1 病毒载量能力验证结果专用报告单（NASBA)附表 6 HIV-1 病毒载量能力验证结果专用报告单（RT-PCR)参考文献缩略语HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_4第一章 总 则1.1 意义HIV-1 病毒载量是艾滋病防治工作中一项重要的实验室检测指标。检测 HIV-1 病毒载量可以监控和预测病程，指导艾滋病患者的抗病毒治疗，包括确定治疗时机、选择治疗方案、评价治疗效果；结合疾病临床症状和其它实验指标，可作为早期感染诊断的辅助手段；还可用于婴儿早期感染的
8、辅助诊断以及采供血机构样品的窗口期检测。为了准确地检测 HIV-1病毒载量，必须对开展 HIV-1 病毒载量检测的实验室进行规范化管理和质量控制，才能保证检测结果的准确性和可靠性。1.2 目的指导 HIV-1 病毒载量检测工作，规范实验室质量控制与管理。1.3 适用范围适用于我国开展 HIV-1 病毒载量检测工作的所有实验室。HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_5第二章 实验室设置各种 HIV-1 病毒载量检测方法需要相应的辅助设备才能完成检测。以下为 HIV-1 病毒载量检测实验室不同分区内必备的辅助设备及耗材。2.1 样品处理区：2.1.1 生物安全柜：二级2.1.2 离心机（3200
9、0g，可离心 1.5mL 管子）2.1.3 冰箱：4，-20，-802.1.4 水浴箱：准确度小于 0.52.1.5 加样器 1 套（20L、200L、1000L） ，为专用设备2.1.6 有滤芯的一次性吸头（无 DNA 和 RNA 酶）2.1.7 计时器2.1.8 旋涡振荡器：震动频率可调2.1.9 一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套2.2 试剂准备区：2.2.1 超净工作台（或密闭工作台）2.2.2 加样器 1 套（20L、200L、1000L） ，为专用设备2.2.3 离心机（18000g，可离心 1.5mL 管子）2.2.4 冰箱：4，-202.2.5 计时器2.2.6 旋涡振荡器
10、，震动频率可调2.2.7 有滤芯的一次性吸头（无 DNA、RNA 酶）2.2.8 1.5mL 管子（无 DNA 和 RNA 酶）和 1.5mL 试管架2.2.9 一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套2.3 扩增产物分析区：2.3.1 HIV-1 病毒载量检测仪2.3.2 加样器 1 套（20L、200L、1000L）2.3.3 冰箱：4，-20HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_62.3.4 水浴箱 ( 41 )2.3.5 旋涡振荡器：震动频率可调2.3.6 有滤芯的一次性吸头（无 DNA、RNA 酶）2.3.7 一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套2.4 HIV-1 病毒载量检测实验
11、室设备分布示意图HIV-1 病毒载量检测实验室设备分布示意图病毒载量仪,加样器扩增产物分析区冰箱样品处理区紫外灯试剂准备区2.4.1 总体原则：各区独立、控制风向、因地制宜、方便工作。具体来说： 2.4.1.1 各区必须是相互独立的，有条件各区内可分别设置缓冲间，以保证不同区之间始终完全分隔开。2.4.1.2 各区的仪器设备以及各种物品必须是专用的。2.4.1.3 试剂准备区和样品处理区可保持低度正压（或常压）状态，使空气流向始终由室内向外，以避免扩增污染物进入此区域。2.4.1.4 扩增产物分析区可保持低度负压状态，使空气流向始终由室外向内，以防止扩增产物造成其他区域的交叉污染。可安装排风扇
12、或其他排风装置。超净工作台加样器冰箱-20，4漩涡振荡器实验台生物安全柜 漩 涡 振荡 器 加样器洗手池离心机冰箱-80，-20紫外灯水浴箱离心机紫外灯冰箱-20，4水浴箱洗手池HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_72.4.1.5 扩增产物分析区可以设在远离其他各区的地方。2.4.1.6 工作时必须遵循单一工作流向进行，即工作流向只能从试剂准备区开始，到样品处理区，然后再到扩增产物分析区。HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_8第三章 样品的采集、处理、保存和运输样品采集、处理、保存和运输，按照所使用检测方法的要求严格执行。用于 HIV-1 病毒载量检测的样品推荐采用抗凝血浆。3.1 样
13、品的采集3.1.1 采样器材：一次性抗凝真空采血管、持针器、蝶形针等。3.1.2 抗凝剂： 通常采用 EDTA（乙二胺四乙酸）或 ACD（枸橼酸钠） ，并符合不同检测方法对样品的要求。3.1.3 样品标识：在采血管上贴对应的样品编号，并填写 HIV-1 病毒载量检测样品送检及接收单（附表 2） 。3.1.4 样品采集量：通常采集全血 35ml, 采集的样品量应尽可能与定量采血管的刻度一致，采集量过多或不足，会造成血液凝固或被稀释。3.1.5 样品的混匀：采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管约 10 次，使血液与抗凝剂充分混匀。3.1.6 获取其它信息：包括采集对象的基本信息和流行病学资料，抗病毒
14、药物使用情况，以往的实验室检测结果，在 HIV-1 病毒载量检测样品送检及接收单（附表 2）上备注栏注明。3.2 样品的处理3.2.1 一般要求在采血后 6 小时内进行离心，室温下 800-1200xg 离心 10 分钟。3.2.2 分离后，吸出血浆，分装到无菌的聚丙烯螺口冻存管中，并注明分装时间。在冻存管上贴样品编号。3.2.3 血浆样品不能灭活。3.2.4 做好样品处理记录。3.3 样品的保存3.3.1 保存条件：根据血浆检测时间而定，4 天内可在 4暂时保存，3 个月以内应冻存于-20以下，3 个月以上应置于-70以下。不推荐使用自动除霜冰箱。3.3.2 血浆样品冻融不应超过 3 次。3
15、.3.3 监控并记录保存温度以及样品状态的变化。3.3.4 防止样品变质、泄漏及污染。HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_93.4 样品的运输根据可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定的要求运输，并严格控制运输的冷冻状态，防止样品冻融。3.5 样品的发送和接收3.5.1 发送样品时必须填写样品 HIV-1 病毒载量检测样品送检及接收单（附表 2） 。3.5.2 接收样品时，核对样品数量，检查样品状况，按 HIV-1 病毒载量检测样品送检及接收单（附表 2）核对。3.5.3 样品管破损造成样品溢出、出现明显溶血、凝血的样品，不宜作 HIV-1 病毒载量检测；如果样品已经融
16、化， 4保存并尽快检测，记录冻融一次。HIV-1 病毒载量检测及质量保证指南_10第四章 常用 HIV-1 病毒载量检测方法简介目前常用的 HIV RNA 测定方法为核酸序列依赖性扩增(NASBA) 技术，代表产品为NucliSens ECL 及其升级产品荧光实时 PCR 技术 NucliSens EasyQ 仪；逆转录 PCR 系统（RT-PCR）技术，代表产品为 AMPLICOR HIV-1 MONITOR assay；分枝 DNA 信号放大系统（bDNA）技术，代表产品为 bDNA 340 分析仪；实时荧光定量 PCR 扩增技术（real-time PCR） ，M2000 与国产试剂盒均
17、属此类技术。41 核酸序列依赖性扩增(NASBA)技术最早产品为 NucliSens ECL 定量 RNA 测定方法，最近被 NucliSens EasyQ 新一代荧光实时定量 PCR 所取代。NASBA 技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶 AMV-RT 和 T7-DNA 多聚酶在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。此方法可分成四个步骤：核酸释放、提取、扩增和测定。扩增后的产物使用 NASBA QR电化学发光（ECL）系统进行检测和定量，此系统包括亲和素标记的磁珠、生物素标记的核苷酸片段（此片段可与新合成的 RNA 产物的一端互补结合）及可特异与四种产物
18、结合的探针（探针上标记有铷元素） ，这四种探针可分别与不同的 RNA 产物结合。将四种探针分别置于不同的反应管内，在适当的条件下（41 0C）几种成分将结合在一起，形成复合体。这些复合体可在 ECL 读数仪中被分别读取铷元素的激发信号，根据野生型病毒核酸测定值与其他三个内标物测定值的比较可得到野生型病毒的拷贝数。Nuclisens EasyQ 结合 NASBA（核酸序列基础分析）技术与分子荧光探针技术（Molecular Beacon）检测血浆中的 HIV RNA 水平。这种结合的方法使用了实时扩增分析（real-time amplification assay） ，提高了对诊断质量的要求。42 逆转录 PCR 系统技术目前用得最广泛的仪器为 COBAS AMPLICOR 和相应的检测试剂 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITORTM 1.5 版。聚合酶链反应人类免疫缺陷病毒 HIV-1 定量检测试剂盒 1.5 版是在聚合酶链反应全自动诊断仪上定量测定人血浆中人类免疫缺陷病毒 I 型（HIV-1）RNA 水平的体外核酸扩增检测试剂盒。该检测试剂盒可以通过两种样品处理程序进行检测，即标准的和超敏感的操作步骤，定量测定含量为 50-750,000 拷贝/毫升 HIV-1 RNA。标准的样品处理程序中，HIV-1
