1、2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐生产工艺设计第 1 页 共 23 页前 言硫酸链霉素的主要成分是链霉素。链霉素（Streptomycin）是瓦克斯曼Waksman S.A.)于 1944年从灰色链霉菌（Streptomyces,griseus）培养液中分离出来的一种碱性抗生素。链霉素是一种相当强的有机碱，也是一种多糖类化合物。其分子结构是由链霉肌、链霉糖和 N-甲基-L-葡萄糖胺三部分以苷键相联结而成的。链霉素碱稳定性特别差，工业产品主要是其硫酸盐形式，即硫酸链霉素(Streptomycin Sulfate)。 链霉素是氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体
2、蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制 结核杆菌生长的作用。由于链霉素肌肉注射的疼痛反应比较小， 适宜临床使用，只要应用对象选择得当，剂量又比较合适，大部 分病人可以长期注射 (一般 2 个月左右)。所以，应用数十年来它仍是抗结核治疗中的主要用药。因此链霉素对结核杆菌有强大抗菌作用，其最低抑菌浓度(MIC)一般为 0.5 mg/L。它对许多革兰氏阴性菌(G-)如大肠杆菌、肺炎杆菌、肠杆菌属、沙门菌属、布鲁菌属等也具抗菌作用。链霉素对革兰氏阳性菌(G+)抗菌活性较差。链霉素游离碱为白色粉末。大多数盐类也是白色粉末或结晶，无嗅，味微苦。链霉素在中性溶液中能以三价阳离子形式
3、存在，所以可用离子交换法进行提取。其水溶液比较稳定，但其稳定性受 PH值和温度的影响较大。其硫酸盐的水溶液在 PH=4-7，室温下放置数星期， 仍很稳定，如在冰箱中保存三个月内活性无变化。 目前抗生素的生产主要是利用微生物发酵来进行，少数采用化学合成的方法，当然也有的采用化学法或生化法半合成。对于链霉素可由灰色链霉菌发酵生 产。双氢链霉素可由湿链霉菌产生，但通常以半合成方法生产。一般认为链霉素是治疗结核杆菌感染的首选药物，除此以外，还用于治疗革 兰氏阴性菌所引起的泌尿道感染、结核性脑膜炎，鼠疫，肠道感染，肺炎，败血症，百日咳等。链毒素的缺点是容易产生耐药性；长期使用对第八对脑神经有毒害除了医用
4、外，也有报道将链霉素用于农牧业的。例我国新疆某生产建设兵团的农场自 1985 年起应用链霉素治疗菜类瓜类和粮食等作物的病害， 取得较好效果； 链霉素还可用于猪肺炎， 雏鸡白痢疾、 以及鸡， 鸭， 鹅的巴氏杆菌感染等的治疗。 国内有些厂家将生产的链霉素作为农用出口，效益较好。2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐生产工艺设计第 2 页 共 23 页硫酸链霉素工业盐即链霉素工业产品（原料药） ，与链霉素相比，其生物活性没有变化，只是在分离纯化工艺中使用了稀硫酸作为离子交换色谱柱的洗脱液。因此使链霉素酸化，故而称为硫酸链霉素和链霉素相比，硫酸链霉素具有化学性质更为稳定，保存期更长的
5、优势，因此工业上常以生产硫酸链霉素为主。1 菌种的选育及制备1.1 菌种的选育1.1.1 菌种活化 取保存期一年内的灰色链霉菌菌株(Streptomyces griseus)冷冻甘油管一支。菌种由中国工业微生物菌种保藏中心提供，编号 CICC11002。用平板划线法将菌种接种于培养基，进行活化，培养配方为：葡糖糖 1%，蛋白胨 0.2%，豌豆汁（13 粒/100ml），氯化钠 0.25%，琼脂 2%碳酸钙 0.02%，PH 调至 7.4；30培养 8日。之后，进行观察：首先观察培养基内菌落菌落是否为为白色丰满的梅花形和馒头形，背面为淡棕色色素菌落；之后，取少量进行涂片，简单染色后观察细胞形态状
6、况，排除形态异常菌落，于斜面固体培养基内传代作为种子使用, 传代培养基成分与活化培养基成分相同。 1.1.2 孢子生产取上一步活化菌种斜面一支，进行种子子培养。产种子培养基成分为：酵母浸膏 2%，七水合硫酸镁 0.05%，磷酸氢二甲 0.05%，葡萄糖 1%，氯化钠0.5%，PH 调至 7.8。培养基灭菌后，于超净台内接种，接种孢子的浓度按 2.5%接入 100ml培养基，30、200rpm 震荡培养 48小时。1.1.3 摇瓶发酵将种子按照 6%浓度分别接种于 5个三角瓶中的生产培养基中进行发酵实验。培养基成分为：黄豆饼粉 5%,玉米淀粉 4%，硫酸铵 0.6%，磷酸氢二钾 1%。30、20
7、0rpm震荡培养 48小时，之后降温至 28，继续震荡培养 96小时。1.2HPLC 法检测发 酵产物含量分别从 5个三角瓶中各取 100l 发酵液，过 0.45m 孔径膜除去杂质，4 摄氏度保存备用。之后，称取 0.05g标品，置于 50ml容量瓶中，加 0.1mol/L氢2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐生产工艺设计第 3 页 共 23 页氧化钠 10ml，60 摄氏度水浴 40min。之后，各加入 1%硫酸铁铵 0.5ml使之与发酵液中的产物络合，之后超纯水定容，过 0.45m 膜除去杂质。色谱柱:选用 SymmetryshieldTM RP18 C18柱(5 m，
8、3.9 mm 150mm)色谱柱，流动相:乙腈-庚磺酸钠溶液(1.0g 庚磺酸钠溶 于 500mL水，体积比 2080)，流量:0.5mL/min，柱温:30C 检测波长 330 nm，进样体积:5.0L，保留时间:2.477 min。 在上述操作条件下，待仪器基线稳定在 1.010-3AU 范围内变化后，连续数针标准溶液进样，当相邻两针的峰面积变化小于 1.5%时，进样顺序为：标准溶液、试样溶液（1 ）、试样溶液（ 2）、试样溶液（3）、试样溶液（4）、试样溶液（5）、标准溶液的顺序进样进行分离和测定。待出峰后计算链霉素含量，并确定单位量灰链霉菌的链霉素产量。若产量达到足够要求，则对菌种进行
9、保存并进行下一步。1.3 菌种的保藏短期保存： 取之前活化菌种适量接种于固体斜面培养基上，30培养 48小时，之后缓慢注入 50%灭菌甘油水溶液。用量可超出斜面 1cm即可，之后将斜面置于 4冰箱进行保存。单支保存期不超过一年。长期保存：取经过 2%盐酸刷洗，超纯水清洗并高温灭菌的安瓿瓶 1支，瓶内加灭菌脱脂牛奶 2ml。之后，接种环刮取活化好并进入稳定期的菌种细胞若干，并将其转移至牛奶中，充分溶解。溶解后，置于-80冰箱预冷 2小时。待溶液冷冻后，将安瓿瓶转移至冻干机冻干。当安瓿瓶中冰块完全冻干后，瓶内抽真空并封口。2 培养基设计及灭菌2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐
10、生产工艺设计第 4 页 共 23 页2.1 培养基类型及其功能微生物大规模发酵设计主要用到孢子、种子、生产培养基以上三种类型。孢子培养基配置得目的主要是活化保藏菌种，并给菌体繁殖孢子提供条件，常采用固体培养基，对这类培养基的要求主要是可使菌体快速生长，并产生大量优质孢子，且无致变异物质。种子培养基主要为孢子出芽、生长、大量繁殖菌丝提供营养物质。并使菌丝生长情况良好，可产生大量种子。酵培养基是供菌体发芽、生长、繁殖、合成产物使用。要求是既能够使种子接种后能迅速生长，可使其达到一定的菌丝浓度，又可以迅速合成产物。2.2 培养基的成分培养基主要成分为水、碳源、氮源、无机盐及微量元素、生长因子、促进剂
11、和抑制剂等几大部分组成。不同的微生物对碳源、氮源及微量元素、生长因子所需含量不同。且相同微生物不同生长时期所需物资也有所不同。故，在工艺设计过程中需考虑培养基中各种物质在不同时期所占比例。2.2.1 碳源碳源主要为微生物提供生长繁殖及其他生命活动所需的能量，为合成菌体和发酵产物提供必须的碳成分。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸、低碳酸及轻链烷烃。通过查阅已有文献资料，本设计采用玉米淀粉作为碳源。2.2.2 氮源氮源主要用于构成菌体细胞的细胞质、蛋白质和其他含氮代谢产物.分为有机氮源和无机氮源。常用有机氮源有花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母抽提物等。常用无机氮源有铵盐、硝酸盐、
12、氨水。相比较有机氮源来说，微生物细胞对无机氮源的吸收效率要由于有机氮源。根据以往文献资料 2，并结合实验比较花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉和铵盐、硝酸盐、氨水几种物质作为氮源时链霉素的产量。本设计选用的碳源分长效碳源和速效碳源，长效碳源为黄豆饼粉，速效碳源为硫酸铵2.2.3 水水是所有培养基的主要构成成分，也是微生物机体的重要组成成分。为避免水质影响，故选用自来水为水源，经过净水机纯化处理引入发酵罐作为生产用2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐生产工艺设计第 5 页 共 23 页水。2.2.4 无机盐及微量元素微生物生长所需的无机盐多种多样，其中最为关键的是钠盐、钾
13、盐。本设计选用磷酸氢二甲和氯化钠作为钾盐和钠盐。2.2.5 其他经查阅文献及实验筛选。本设计中，培养基内将在发酵 100 小时时添加 1%巴比妥酸衍生物及钙离子。2.3 培养基优化虽然培养基成分确定，但需要调整不同物质浓度达到适宜浓度。适宜浓度培养基应具备利用率高、转化率高的特点。转化率分理论转化率和实际转化率。理论转化率可由反应方程式物料衡算求得。实际转化率则需要实验确定。本设计采取单因素实验选择最优成分，正交实验选取最佳浓度及组合。首先进行单因素实验，筛选合适碳源、氮源。复合碳源在淀粉、麦芽糖、蔗糖、甘油之间选择，复合氮源在花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、青霉菌菌丝水浸提物和黄豆粉
14、抽提物之间进行筛选。最后，多因素实验，并计算 K、R 值。最终选择玉米淀粉和黄豆饼粉作为主要的碳源和氮源。3 灭菌3.1 培养基灭菌本实验采取湿热蒸汽灭菌，条件为 121、大气压 0.1MPa进行。灭菌时间由经验公式2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐生产工艺设计第 6 页 共 23 页计算求得灭菌时间。公式中： 为灭菌时间N为经过 时间灭菌后微生物数量，N0为培养基灭菌前微生物数量，通常通过实验计数求得。3.2 空气灭菌3.2.1 过滤除菌流程及设备由于采用 AtlasCopcp成套服务方案，故本设计空气净化流程如下：采风塔OSS 空气净化器 空气压缩机 冷却器空气储罐
15、油水分离器空气换热器设备如下：1.采风塔：考虑到太原地区风向流动问题，采风塔选址位于厂区西北侧，远离下风处，高 20m，气流 8m/S2.空气压缩机：选用 AtlasCopcp公司 ZH+型离心式无油空气压缩机，流量1200L/s-4800L/s。3. 空气净化器：选用 AtlasCopcp公司 OSS空气净化分离器。该分离器对 2m左右颗粒分离效率可达到 75%，且耐蒸汽灭菌。4.空气冷却器；压缩后空压机出口温度约为 120，故添加列管式热交换器。换热面积由公式计算求得考虑热损失，实际换热面积为理论换热面积的 120%。5. 空气储罐：储量由公式 VR=0.1V1 V1为空气压缩机每分钟排气
16、量。计算后，决定选用 AtlasCopcp公司 2000m3储气罐两个。罐体高径比为 2.5。储罐适用温度范围为-40-40。7.油水分离器：考虑到空气中存在一定数量的油状液滴,OSS 过滤器主要分离固体物质。因此在此加入 AtlasCopcp公司 OSC油水分离器，以除去油状液滴，可耐高压蒸汽灭菌。根据供货商提供数据，本设计选用 QSC-2400 型油水分离器。设备-40-40。8.空气换热器：考虑山西地区冬夏气温差异较大。不同时期所需的空气温度，2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐生产工艺设计第 7 页 共 23 页故选用 AtlasCopcp公司 1600-CMF 空
17、气干燥热交换器。交换器腔体内通过过滤空气，腔体外通过电加热/冷却剂降温。夏季可降低空气温度，冬季可提高空气温度。由于发酵生产需要高洁净度空气，因此在生产前应向供气管路中通入足量高压蒸汽进行灭菌。考虑设备具有较高耐受能力，故蒸汽压力选择在 0.20.4MPa之间，灭菌时间为 45min。3.2.2 无菌空气检查为保障通入罐体内的空气为无菌空气，故需要对空气进行检查。为简化工作流程，减少工作量。本设计采用撞击式空气微生物采样器对净化空气中的微生物数量进行计数。3.3 发酵罐灭菌发酵罐可采取空罐灭菌和实罐灭菌。本设计采取空罐灭菌法对发酵罐及附属管道设备进行灭菌。工作流程是：首先，关闭阀门，蒸汽由上部
18、进入，压力维持在 45kg/m2,温度维持 160。对管道及罐体内部进行冲刷当罐体内温度80 后，减小蒸汽供应量，继续向罐体内通入蒸汽，维持气温121， 0.2MPa，时间 30min。减小通气量后，继续观察罐体内温度值，当罐体内温度达到 118后，计时30min。计时结束后，关闭蒸汽阀，向罐体内通入无菌空气，使罐内维持正压，并在罐外通冷却水冷却罐内温度至 55以下。4种子扩大培养本设计采取三级种子罐工艺流程，设流程如下：孢子锥形瓶种子罐 种子罐发酵罐。首先进行种子的活化培养，之后进行初步扩增，然后进入种子罐，再次扩增两次。4.1 实验室种子制备取之前保存的石蜡油斜面两支，在超净台内分别取少量
19、菌种接种于孢子培养基平板上。养配方为：葡糖糖 1%，蛋白胨 0.2%，豌豆汁（13 粒/100ml），氯化2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐生产工艺设计第 8 页 共 23 页钠 0.25%，琼脂 2% 平板活化后，即可进行摇瓶扩大培养，以获得足量菌丝体作为种子。液体培养基配方为：取上一步活化菌种斜面一支，进行种子子培养。产种子培养基为：酵母浸膏 2%，七水合硫酸铵 0.05%，磷酸氢二甲 0.05%，葡萄糖 1%，氯化钠0.5%，PH 调至 7.8。孢子浓度按 2.5%接入 100ml培养基，30、200rpm 震荡培养 48小时，光照充足。4.2 生产车间种子扩大培养
20、一级种子罐扩大培养：取一瓶活化情况较好的菌丝体，用压差接种法接种于种子罐进行扩大培养。在 30条件下培养 24小时，之后进行二级种子罐的扩增。要求供氧良好，搅拌转速为 350rpm。二级种子罐扩增：将一级种子罐内细胞以压差法移入二级种子罐，接种量按6%进行接种。接种完成后，30 摄氏度培养 24小时，使细胞进入对数生长期。要求供氧良好，搅拌转速为 350rpm。发酵罐生产培养。将经过二级种子罐扩增的细胞移入三级种子罐，接种量控制在 10%左右。首先，于 30摄氏度培养 48小时，使细胞进行大量繁殖。之后，降温至 28摄氏度，培养 96小时，转入产物合成阶段。生产培养基配方为：黄豆饼粉 5%,玉
21、米淀粉 4%，硫酸铵 0.6%，磷酸氢二钾 1%。要求供氧良好，搅拌转速为 350rpm。另外，在发酵进入到产物合成阶段时，补料内添加 1%巴比妥衍生物。5 发酵过程参数控制5.1 发酵过程补料控制根据参考文献和已有生产经验，本设计采用分批补料发酵工艺。由于链霉菌发酵周期为 48小时（生长期）+96 小时（产物合成期），所以补料时期选在生长期后期开始进行补料。一个批次共补料类次。分别是：补全料：一个发酵周期约补 3次。每吨发酵液约补 370L 全料。从发酵 20 小时 2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐生产工艺设计第 9 页 共 23 页开始补全料，至 30 小时时结束。
22、根据发酵液还原糖含量水平控制具体补全料体积及时间。补稀料：一个发酵周期补 2 次左右。每吨发酵液约补 200L 稀料。自发酵 40 小时 后开始补稀料，根据发酵液还原糖含量水平控制，保持还原糖浓度大于等于2.6g/100ml。补氨水：自发酵 33 小时开始补氨水，每 4 小时补一次，每次 10-15L，使发酵液 中氨氮浓度不低于 45mg/100ml。补氢氧化钠:调节发酵液 pH，保持发酵液 pH 在 6.8-7.2 之间 。5.2 发酵过程 PH 控制pH值直接影响到发酵过程中各种酶活动，影响菌体对基质代谢的速度，甚至改变菌体的代谢途径及细胞结构。菌体的发育生长和抗生素的合成有不同的适宜 p
23、H值。发酵过程中 pH 值必须予以控制，才能符合菌体生长和抗生素合成的 需要。影响 pH 值的因素有生化反应过程特性，以及发酵过程的环境变量，如温度。另外，作为发酵过程氮源的硫酸铵和碳源的糖等补料加到发酵液中也会 影响 pH值。 适合链霉菌菌丝生长的 pH 约为 6.57.0，适合于链霉素合成的 pH 约为 6.87.3，pH 低于 6.0 或高 7.5，对链霉素的生物合成不利。pH 对链霉素发酵影响很大，故很多国家为了准确控制 pH 值，使用 pH 自动控制装置。这样，可提 高发酵单位，又可以减少培养基中碳酸钙的用量，在发酵液预处理时，还可减少中和用的酸量。 本设计采用参考文献3中的 PH调
24、节程序进行 PH调节控制。5.3.发酵过程中温度控制由于灰色链霉菌对温度敏感。且生长适宜温度（30）和生产适宜温度2017 年发酵工程设计年产 300 吨硫酸链霉素工业盐生产工艺设计第 10 页 共 23 页（28）不同，所以需要对温度进行调控。在生长期，需恒定温度在30，生产期需要恒定温度28。因此在生产过程中，分期检测调整温度恒定范围。使不同时期均可以达到最适宜温度。5.4 发酵过程中溶氧调控链霉素产生菌一灰色链霉菌是一种高度需氧菌。它在整个代谢过程中以葡萄 搪做为主要碳源，只有以氧做为最终电子受体时方能获得大量能量，来满足菌体 生长、繁殖和合成链霉素的需要.物质代谢与能量代谢是相辅相成的
25、。据文献记载，空气中，氧在培养液中的饱和浓度(1atm, 25C )大约只有 0.2 毫克分子 (O2)/升，而链霉素发酵液中菌体的摄氧率在 1050 毫克分子(O 2)/升小时。因此向 发酵液中迅速地补充溶解氧.是链霉素发酵中的重要问题。 对溶氧水平有较大影响的因素主要有:a、菌体代谢是否旺盛。 b、培养液的粘度:过高的粘度会影响氧的传递，即影响氧由气相溶解于液相之中。c、补料:补糖后糖代谢加快，补入 10秒钟后溶氧即明显下降，但经 3040 分钟后又逐渐恢复到补前水平。这种变化当补糖量超过 1.0%时较明显。当补无机氮源使氨基氮增加 l0mg/100ml 以上时，亦有这种变化。 d、罐压:
26、实验证明罐压对溶氧的影响较空气流量对溶氧的影响更为明显。 在菌体生长前期，空气流量在一定范围内的增减对溶氧几乎没有什么影响，而罐 压变化则溶氧变化明显。在培养前期，一般罐压每升高或降低 0.lkg/cm2 溶氧浓 度就升高或降低 4%左右;在培养中、后期，罐压每升高或降低 0.lkg/cm2 溶氧浓度就升高或降低 3%左右。但罐压不能控制过高，超过一定限度对菌体的生长、代谢就要产生不良影响。 e、空气流量:体积氧传递系数中 Vs 为空气在罐中的直线速率，它与空气流 量是等效的。从提高 KLa 的角度看，应尽量增大 Vs,但超过一定限度后溶氧浓度 不再上升，反而会造成泡沫上升，发酵中间产物未及被利用即被带出而造成不良 后果，甚至使搅拌器周围充满气泡从而使搅拌失去作用，造成溶氧下降。从价值 工程原理出发，应确定一个最适空气流量 vs，即不使通气量过剩，又满足灰色 链霉菌对氧的需求。 f、搅拌:搅拌对溶氧浓度影响最大。在培养过程中如停止搅拌、溶氧浓度 迅速
