1、.装订线山 东 农 业 大 学毕 业 论 文题目：辣椒内生拮抗菌的分离与鉴定 学 院 生命科学学院 专业班级 2013级生物工程 4 班 届 次 2017届 学生姓名 罗雪芹 学 号 20137257 指导教师 刘丽英 副教授 二 O 一七 年 五 月 二十八 日.一、指导教师评语根据学生实习及撰写论文情况进行评定： 1、对待实习的态度及实习纪律的遵守情况； 2、能否准确熟练地进行观察记载、搜集整理、查阅资料及运用数据的水平； 3、能否准确熟练地进行各项操作，并运用所学知识解决实际问题； 4、能否很好地完成任务书规定的工作量。 二、评阅教师意见参照以下几方面进行评定： 1、论文选题的实用性、分
2、析的科学性和体系的完整性； 2、获取资料是否丰富，处理资料是否科学、严谨； 3、综合运用基础理论和专业知识的深度、归纳、概括及运算的能力； 4、文字表达能力，文章的逻辑性。 三、论文答辩成绩由答辩小组根据学生语言表达能力及回答问题的准确性进行评定。 四、论文综合评定成绩按优秀、良好、中等、及格和不及格五级计分。 五、毕业论文的成绩评定按照毕业论文评分标准综合评定。 六、论文由学生本人按照毕业论文（设计）规范用计算机排版、打印，一律使用统一封面（A4K）。 七、学生的论文文本（含任务书、图片等）由学院按学校规定存档。 目录中文摘要 .1英文摘要 .11 前言 .21.1 辣椒主要治病及其防控 .
3、21.2 内生菌种类及内生细菌的生防作用 .21.3 植物根组织内生菌的研究意义 .32 材料与方法 .42.1 培养基 .42.2 试剂 .52.3 实验仪器 .52.4 样本 .52.5 试验方法 .62.5.1 内生细菌的分离 .62.5.1.1 样本的处理 .62.5.1.2 内生细菌分离 .62.5.2 拮抗实验 .62.5.2.1 接菌培养 .62.5.2.2 菌丝染色 .62.5.3 形态观察及革兰氏染色 .62.5.4 生化实验 .72.5.5 测序及系统进化树的构建 .82.5.6 解磷解钾实验 .82.5.7 十字交叉实验 .83 结果与分析 .93.1 内生细菌的分离及拮
4、抗结果 .93.1.1 内生细菌对病原菌的拮抗效果 .93.1.2 内生细菌对病原菌菌丝的抑制结果 .103.2 形态鉴定 .113.2.1 菌落形态观察 .113.2.2 菌体形态 .113.3 生化鉴定结果 .123.4 16S rDNA 鉴定结果 .133.5 解磷解钾及十字交叉结果 .144 讨论 .145 结论 .15参考文献 .16致谢 .18CONTENTSAbstract in Chinese .1Abstract in English.11 Introduction.21.1 The main treatment of pepper and its prevention an
5、d control .21.2 Endophytic bacteria and endophytic bacteria biocontrol .21.3 Significance of Endophytic Bacteria in Plant Root Tissues.32 Materials and methods .42.1 Medium .42.2 Reagent.52.3 Experimental apparatus.52.4 Sample.52.5 Test method.62.5.1 Separation of Endophytic Bacteria.62.5.1.1 Handli
6、ng of samples.62.5.1.2 Endogenous bacterial isolation .62.5.2 Antagonistic Experiment.62.5.2.1 Inoculation culture .62.5.2.2 Mycelial staining.62.5.3 Morphological observation and Gram stain.62.5.4 Biochemical Experiments .72.5.5 Equencing and Construction of Phylogenetic Tree.82.5.6 Experiment on D
7、issolving Phosphorus and Potassium.82.5.7 Cross Experiment .83 Results and Analysis .93.1 Endogenous bacterial isolation and antagonism results.93.1.1 Antagonistic effect of endophytic bacteria on pathogens .93.1.2 Endogenous bacteria on the pathogen mycelium inhibition results.103.2 Form identifica
8、tion.113.2.1 Observation of colony morphology .113.2.2 Cell morphology .113.3 Biochemical identification results.123.4 16S rDNA identification results.133.5 Dissolved Phosphorus and Potassium Crossing Results.144 Discussion .145 Conclusion.15Reference.16Thanks.18山东农业大学学士学位论文1辣椒根部内生拮抗菌的分离与鉴定作者：2013 级
9、生物工程专业 4 班 罗雪芹指导老师：刘丽英副教授摘要：炭疽菌、根腐菌等致病真菌是引起辣椒植株患病的主要原因之一，病原菌对辣椒产生的病害使辣椒减产甚至绝收，给农业的收入带来了严重影响。而生物防治是当前的主流，因此筛选出对辣椒致病菌有较好抑制效果的生防菌具有十分重要的意义。本实验从辣椒根部分离筛选出 19株内生细菌；然后进行拮抗实验，通过平板对峙筛选出 3株对腐皮镰刀菌、植保镰刀菌、层出镰刀菌、串珠镰刀菌、链格孢菌、炭疽菌、番茄根腐菌具有较好抑制效果的拮抗菌；再通过形态特征、生理生化指标结合16srDNA序列同源性分析，最终确定 LSB-68、XXRB-1 为枯草芽孢杆菌，XYRB-11 为漠海
10、威芽孢杆菌。此三株菌在生物农药方面具有潜在的应用价值,并可能将在植物病害的生物防治方面发挥重要作用。关键词：生物防治；内生菌；拮抗；鉴定；芽孢杆菌Isolation and Identification of Endophytic Antagonistic Bacteria from Pepper RootAbstract: Pathogenic fungi such as anthrax and root rot fungi are one of the main causes of the disease of pepper plants. The disease caused by ch
11、rysanthemum causes the pepper to be cut or even harvested, which has a serious impact on the income of agriculture. And biological control is the current mainstream, so the screening of chili bacteria have a better inhibitory effect of biocontrol has a very important significance. In this experiment
12、, 19 strains of endophytic bacteria were isolated from the roots of pepper. Then, three strains of Fusarium oxysporum fusarium, Fusarium spp. Fusarium, Fusarium moniliforme, Alternaria alternata, The results showed that LSB-68 and XXRB-1 were Bacillus subtilis, and that of XYBB-11 was determined by
13、morphological characteristics, physiological and biochemical indexes and 16s rDNA sequence homology analysis. Bacillus subtilis. The three strains have potential application value in biological pesticides and may play an important role in biological control of plant diseases.Key words: biological co
14、ntrol; endophytic bacteria; antagonism; identification; Bacillus辣椒根部内生拮抗菌的分离与鉴定21 前言辣椒由于其独特的风味深受人们喜爱，随着农业设施的快速发展，已成为一种四季蔬菜。受其经济效益的促使，种植范围和面积不断扩大，种植密度不断增大，同时，辣椒病害的发生也呈逐年上升趋势。辣椒病害不仅使辣椒减产，严重时可造成辣椒因死棵而绝收，给辣椒生产带来严重的影响，因此正确防控好辣椒病害对提高辣椒的产量和质量有着重要意义 1。1.1 辣椒主要治病及其防控炭疽菌、番茄根腐菌、链格孢菌以及多种镰刀菌是常见的植物致病真菌，通常会引起植物患病，
15、导致植株叶片枯萎，长斑，根腐，绝产等，严重影响了辣椒的产量。例如炭疽菌，它通常引起辣椒黑点炭疽病，是辣椒果实的主要病害之一，同时也能引起烂果、枯枝和叶斑等症状，严重影响辣椒品质，造成辣椒减产甚至绝收 2。而辣椒根腐病有多种表现症状，但通常病部仅局限于根部和茎基部。植株发育不良，较矮小，后期病株白天萎蔫，傍晚至次日清晨尚可恢复，反复多日后植株枯死，病株茎基部及根部皮层变为褐色至深褐色，呈湿腐状，然后病部缢缩、腐烂，皮层易剥离，露出暗褐色的木质部，最后植株整个根系腐烂，萎蔫死亡 1。链格孢菌则能使植株形成大量的坏死型病斑,造成叶枯,提早落叶等症状 3，且其分泌的毒素能抑制植物幼苗的生长。镰刀菌不但
16、会造成辣椒等植株根、茎、叶的腐烂萎蔫，引起苗枯、穗腐、植物种子、块茎的腐烂等病害，导致作物严重的减产和损失 4；而且产生多种作为此生代谢产物的真菌毒素，能杀死植物细胞核，或者富集在种子里，食用后引起人体器官的衰竭和癌变 5。在农业上，辣椒病害对其生产带来了严重的影响，化学防治和生物防治是作物真菌病害的主要防治途径。而传统的农药防治方法不仅效果差、成本高，而且污染环境，相较于化学防治，生物防治作为当前的流行趋势，具有无毒无害、无污染、不产生抗药性和持续高效等优点，符合农业可持续发展的要求，是当前和未来植物病害综合防治的发展方向 6。植物病害生物防治主要是利用有利微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治，其核心就是微生物，这些微生物包括细菌、真菌和放线菌等。其中一些微生物存在于植物各组织部位，具有与植物共生，不存在植物间拮抗等优点，成为目前研究的热点，这类微生物即内生菌 7。1.2 内生菌种类及内生细菌的生防作用Hallmann (1997) 8 首次完整地将植物内生菌(endophyte)定义为能够在健康植物活组织内生存而不引起明显寄主植物病变的一大类微生物。内生菌的种类十分繁多，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌三大类。
