1、中药材中鞣质含量测定方法的研究与优化摘要: 参照药典,采用磷钼钨酸 - 干酪素比色法 ,以没食子酸为对照测定五倍子、地榆药材中鞣质的含量。探讨药典中规定的条件合理性，并增加了超声条件优化了实验，平均加样回收率为 97.39 %。本法可快速、准确地用于中药材中鞣质的含量测定,并可作为鞣质提取工艺的优化方案。关键词: 鞣质测定;波长；室温浸提；干酪素；没食子酸；超声鞣质又称单宁(Tannins) ,是一类复杂的具有沉淀蛋白质性质的水溶性多元酚类化合物 ,广泛存在于植物药材 ,如五倍子、贯众、儿茶等。近年来,对鞣质生理活性的研究方兴未艾。研究表明,鞣质能清 除生物体内过剩的自由基,维护细胞膜的流动和
2、蛋白质的构象 ,防止辐射诱发的 DNA 断裂 ,从而在抑制脂质过氧化、心血管病、抗癌、抗突变、抗衰老、抗白内障等方面有独特功效。鞣质的经典含量测定方法有很多种 ,如重量法、容量法、比色法等。最常用的有皮粉法、高锰酸钾法、干酪素法、络合量法。皮粉法是国际公认的鞣质含量测定方法。皮粉的主要成分是蛋白质 ,鞣质可通过分子中的酚羟基与蛋白质的酰胺基形成氢键而结合成不溶于水的沉淀,以重量法测定含量。 中国药典一部1鞣质含量测定法一直沿用皮粉法 ,适用范围广。缺点是耗用样品多,测定时间长 ,且没有选择性 ,测定结果偏高 ,而且皮粉用量很大。近年来,皮粉试剂的供应和质量都很难保证,使皮粉法的应用受到很大限制
3、。 英国药典2002 版2鞣质测定法附录采用的是磷钼钨酸 - 皮粉比色法,即利用鞣质在碱性溶液中将磷钼钨酸还原产生深蓝色,其吸收度与含量成正比,采用比色法测定。其中,以焦性没食子酸为对照,测定总酚和不被皮粉吸附的酚,二者之差计为鞣质的含量。罗文毓等报道了改进的干酪素法3 ,其关键步骤是以干酪素代替皮粉,采用磷钼钨酸比色法测定; 药材样品提取采用浸泡过夜代替加热回流提取等。本文参照英国药典和干酪素法,重点对提取方法、显色剂、干酪素用量等进行了比较,提出了鞣质含量测定方法,为药典相关附录方法的修订提供了实验基础。 中国药典42015年版 2202 鞣质含量测定法已为没食子酸为对照，测定测定总酚和不
4、被干酪素吸附的酚,二者之差计为鞣质的含量。并且同时进行干酪素吸附空白试验，计算时扣除空白值。实验为避光操作。4 本研究对中药主要的化学活性成分鞣质提取工艺的优化，有利于地榆资源进一步的开发、利用，并为中药材有效成分的富集提供理论依据。并改进鞣质含量测定方法。1 仪器与试剂18 系列紫外可见分光光度计【2007（C）北京普析通用仪器有限责任公司】; KQ-250B 型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司） 。钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、无水碳酸钠;磷酸、盐酸、干酪素、鞣酸（分析纯）; 焦性没食子酸、没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，经色谱分析，纯度98，) ;五倍子、地榆药材(购自中药材市场
5、)。2 实验方法探究21 测定波长的选择探究 取对照品、总酚和不被吸附的多酚比色液 ,在 4001000nm 波长测定 ,结果三种比色液均在 760nm 具最大吸收。绘制不同波长总酚比色液吸收曲线和不被吸附的多酚比色液吸收曲线。结果表明，确定测定鞣质含量最大吸收波长为 760nm。22 供试品溶液制备方法的比较探究5英国药典2000 版鞣质测定法药材供试液提取方法采用加热提取 ,罗文毓等报道,鞣质遇热不稳定,采用室温浸提过夜的方法操作简单,提取完全。本试验对加热和冷浸提取两种方法进行了比较。分别测定次数 5 次。冷浸过夜提取测定含量高于加热提取法,且操作较简单。结果表明,测定鞣质含量供试品处理
6、应采用室温浸提过夜的提取方法。23 吸附剂的比较探究5英国药典法采用皮粉作为吸附剂测定不被吸附的多酚类。参考文献3干酪素对鞣质的吸附更具专属性,即可选择性吸附有生理活性鞣质,而鞣酐等非活性鞣质则不被吸附,选择性较皮粉法高。以鞣酸为例,试验分别采用皮粉和干酪素为吸附剂 , 测定含量。结果皮粉法测定值为 81118 % ,干酪素法测定值为 62126 %。结果表明,测定鞣质含量吸附剂应为干酪素。2 4 干酪素用量的比较探究试验考察了干酪素的用量对测定五倍子鞣质含量结果的影响。干酪素用量的影响： 干酪素不同用量时测定含量 3 次取其平均值，测得干酪素用量和对应测得的含平均值为下:0.15g-18.2
7、6%,0.30g-23.24%，0.45g- 32.72%, 0.60%g- 32.82% , 0.75g-32.62 % ,0.90g- 32.86% 结果表明 , 对于测定样品 , 三倍取样量的干酪素用量基本可吸附完全。试验使用干酪素 0.6 克。5结果表明,测定鞣质含量干酪素用量为 0.6g。2 5 对照品的比较探究5英国药典2000 版鞣质测定法附录采用焦性没食子酸为对照品,试验表明焦性没食子酸很不稳定,溶液在室温放置很快变色 ,必须新鲜配置使用。考虑到没食子酸具有相似的结构和显色行为 ,且已有含量测定用对照品,可以作为鞣质含量测定对照物质。实验比较了焦性没食子酸和没食子酸分别作为对照
8、的测定情况。以鞣酸含量测定为例, 采用不同对照物比较测定结果: 以没食子酸对照, 测得含量平均值为 62.26 % ,以焦性没食子酸对照,测得含量平均值为45.45 %。以没食子酸对照 , 含量值较高。结果表明,测定鞣质含量时对照品应采用没食子酸。2. 6 超声辅助的优化比较探究62.6.1 单因素考察2.6.1.1 超声辅助提取的次数取干燥的地榆根粉末适量，加入 15B/V 的 60% C2H5OH，分别提取 1、2、3、4、5 次，每次 60 分钟。提取物经测定吸光度，计算含量结果提取次数对的总鞣质的提取量有一定差异，但 3、4、5 次差异不大，故而选定超声次数 1、2、3 次作为正交试验
9、考察的因素水平，进一步考察超声辅助提取次数对提取的影响。2.6.1.2 超声辅助提取的时间取干燥的地榆根粉末适量，加入 15B/V 的 60% C2H5OH 溶液，并依此超声提取 20 分钟、40 分钟、60 分钟、80 分钟、100 分钟。提取物经测定吸光度，计算含量结果表明 20 分钟到 60 分钟提取量逐渐上升，故而选定 45 分钟，60 分钟，75 分钟作为正交实验考察的因素水平，进一步考察超声辅助提取的时间对提取的影响。2.6.1.3 溶剂浓度取干燥的地榆根粉末适量，分别加入 15B/V 的 30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、80% C2H5OH， 超声提取 60 分
10、钟。提取物经测定吸光度， 计算含量结果表明 70% 、60%C2H5OH 提取结果最好，故而选定 50%、60%、70% C2H5OH 溶液作为正交实验考察的因素水平，进一步考察溶剂浓度对提取的影响。2.6.1.4 溶剂用量取干燥的地榆根粉末适量，分别加入5、10、15、20、25、30B/V 的 60%C2H5OH，超声提取 60 分钟。提取物经测定吸光度，计算含量结果表明 15B/V 的 60% C2H5OH 提取结果最好，故而选择 10、15、20B/V 的溶剂用量，作为正交实验考察的因素水平，进一步考察溶剂用量对提取的影响。2.6.3 L9 （34）正交试验设计通过单因素实验的结果考察
11、，选择超声辅助提取次数 A、超声辅助提取时间 B、溶剂浓度 C、溶剂用量 D 为考察的四组因素，采用 L9 （ 34）正交试验设计方法，确定地榆中总鞣质的最佳提取方法为 A3C3B2D2，即为超声波辅助提取 3 次，每次 60 分钟，溶剂为15B/V 的 70%C2H5OH。通过显著性检验及方法分析，得出各因素对地榆中总鞣质提取效果影响的主次顺序为 ACBD。依照正交试验的结果重复试验 5 次，计算得 RSD 为 1.74%。结果表明，测定鞣质含量时最佳提取方法为超声波辅助提取 3 次，每次 60 分钟，溶剂为 15B/V 的 70%C2H5OH。2. 7 显色剂的稳定性探究加入显色剂磷钼钨酸
12、试液，分别于15min、30min、45min、60min、75min、90min 后测定吸光度，发现磷钼钨酸显色 30 分钟后反应完全, 显色溶液在 3 小时内稳定。结果表明，测定鞣质含量时自加入磷钼钨酸显色 30 分钟后测定吸光度较好。2. 8 碱性浓度的优化探究药典规定，测定鞣质含量时所使用的碳酸钠碱性溶液的浓度为29%，温度为碳酸钠的溶解度影响较大，且高浓度的碳酸钠较易析出结晶，影响测定结果，多采用低浓度碳酸钠溶液，实验分别用20%，25%，29%，35%碳酸钠测定结果，取没食子酸对照品溶液（0.05mg/ml）2ml,进行显示测定，结果表明，四者吸光度基本一致。结果表明，测定鞣质含量
13、时应采用 20%碳酸钠。2. 9 实验光照度的探究强光照射会使显色体系吸光度下降。结果表明，测定鞣质含量时需要使用棕色容量瓶并且避光操作。3 方法学验证31 线性关系考察本法为标准曲线法 , 每次测定 5 个均随行测定 , 做 3 次测定数据 , 表示线性关系情况 。32 重复性试验取样品 6 份 , 按正文方法测定, 测得含量结果，重复性试验结果测定次数 6 次对应含量( %)分别为： 1- 42.80 2 -41.75 3 -41.02 4 -42.49 5 -42.53 6- 42.74 3 3 回收率试验取同一样品 4 份,分别精密称取约 75mg ,置 250ml 量瓶中,分别精密加
14、入鞣酸溶液 27.09mg (以没食子酸计含量为 62126 %) 50ml ,加水 100ml ,按供试品溶液制备方法制备,并按总酚和不被吸附的多酚测定法分别测定含量,计算回收率。回收率试验结果如下：测定次数样品中含量(mg) 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率( %)1 33.26 27.09 59.37 96.382 34.56 27.09 60.66 96.333 33.85 27.09 60.47 98.264 34.70 27.09 61.41 98.60平均值 97.39% RSD 值 1.24%4 样品测定4.1 对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品 50mg ,置 10
15、0ml 棕色量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,精密量取 5ml,置 50ml 棕色量瓶中,用水稀释至刻度，摇匀,作为对照品溶液。42 标准曲线的制备精密量取对照品溶液 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml , 分别置 25ml 棕色量瓶中,各加入磷钼钨酸试液 1ml,再分别加水 11ml、10ml、9ml、 8ml、7ml , 用 20%碳酸钠溶液稀释至刻度,摇匀。以相应的试剂为空白,照分光光度法,30 分钟后,在 760nm 波长处测定吸收度,以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。4. 3 供试品溶液制备取地榆药材,粉碎,过三号筛,分别称取 0.15g 和 0.75
16、g,精密称定,置 250ml 棕色量瓶中,加水 150ml,放置过夜,超声波辅助提取 3 次，每次 60 分钟，溶剂为 15B/V 的 70%C2H5OH,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,静置 (使固体物沉淀),滤过,弃去 50ml 初滤液,精密量取续滤液 20ml,置 100ml 棕色量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。4. 4 测定4.4.1 总酚测定 精密量取供试品溶液 2ml,置 25ml 棕色量瓶中,照标准曲线制备项下的方法,自“加 入磷钼钨酸试液 1ml”起, 加水 10ml,同法测定吸收值,从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量 (mg) ,计算,即得。4.4.2 不被吸
17、附的多酚测定取供试品溶液 25ml ,加至已盛有 0.6g 干酪素的 100ml 具塞锥形瓶中,密塞,置 30 水浴中保温 1 小时 ,时时振摇,取出,放冷, 摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液 2ml,置 25ml 棕色量瓶中, 照标准曲线制备项下的方法,自“加入磷钼钨酸试液 1ml”起,加水 10ml,同法测定吸收值,从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量 (mg) ,计算,即得。4.4.3 干酪素吸附空白试验取供纯化水 25ml ,加至已盛有 0.6g 干酪素的 100ml 具塞锥形瓶中,密塞,置 30 水浴中保温 1 小时,时时振摇,取出,放冷, 摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取
18、续滤液 2ml,置 25ml 棕色量瓶中,照标准曲线制备项下的方法,自“加入磷钼钨酸试液 1ml”起,加水 10ml,同法测定吸收值,从标准曲线中读出空白干酪素的量（mg） 。鞣质含量 = 总酚量 - （不被吸附的多酚量-空白干酪素的量）(减去水分含量，以干燥品计算)样品测定结果 13.96% 13.72% 平均值 13.848.0%（药典规定）以前的中国药典鞣质含量测定法一直沿用皮粉法 ,该法确为经典方法 , 但专属性不强 , 皮粉用量大, 试验周期长 , 已不适用于日常分析测定。2015 年版药典修订提出了的新方法 ,在专属性和测定精密度等方面都有了明显的提高,试验周期也大大缩短 (除样品
19、过夜提取外,一般仅需要 4 小时) 。本法对于 2015 年版药典相关品种鞣质含量测定方法的改进进行了探究与数据分析验证，并在此基础上进行了优化。 参考文献:1 中国药典 S1 一部 , 2000 : 附录 632 B1P2002 , M1 Tannins in Herbal Drugs3 罗文毓 等 中药中鞣质含量测定方法的比较研究 J 1 药物分析杂志 1990 , 10 (4) : 244 国家药典委员会中国药典 2015 年版 四部 2202 鞣质含量测定法5王 坤 ,鲁 静 1 (吉林省长春市药品检验所,130062 ; 1 中国药品生物制品检定所) 中国药事 2004 年第 18 卷第 6 期6杂志 吉林农业 2016 年 第 24 期
