1、目 录中 文 摘 要.1英 文 摘 要.2前 言.3正 文.4参 考 文 献.9致 谢.11- -1抗生素预处理留置导尿管对大肠埃希菌所致尿路感染的预防摘要 目的 观察抗生素代替传统石蜡油润滑导尿管后生物膜的形成情况，为减少由留置导尿管引起的尿路感染提供方法及理论依据。方法 制备大肠杆菌，试管稀释法确定MIC，药敏试验，体外用平板法在硅胶导尿管膜片表面经过 3d孵育建立生物膜模型，并用扫描电镜观察生物膜的形态，通过菌落计数法定量了解本实验的方法比传统方法在减少尿路感染上的优势；用冲洗、冲洗+超声振荡2种方法处理附有不同生长时期生物膜的导尿管，通过菌落计数法了解2种方法对不同时期生物膜的清除效应
2、以及减少由冲洗方法引起的误差。结果 扫描电镜观察导尿管膜片的生物膜内均有细菌团块聚集，可见纤维素样物质交联。不同处理方法结果表明，在生物膜形成的初期，2种处理方法具有相似清除效应；但当生物膜趋于成熟后，单用冲洗方法难于将黏附细菌洗脱下来，2种方法的效应强弱顺序为：冲洗+超声振荡冲洗。结论 用抗生素预处理的导尿管形成的生物膜数量较少，而对照组形成的生物膜数量较多。因此，建议使用抗生素预处理硅胶导尿管，并且在生物膜形成初期，对导尿管一般冲洗能较彻底地清除粘附细菌，在生物膜形成后期，使用冲洗+超声振荡效果好一些。关键词 抗生素预处理导尿管；大肠埃希菌；生物膜；扫描电镜；冲洗；菌落计数抗生素预处理留置
3、导尿管对大肠埃希菌菌所致尿路感染的预防- 2 -Antibiotic pretreatment indwelling catheter for prevention of Escherichia coli in urinary tract infectionAbstract Objective To observe the formation of antibiotics instead of traditional paraffin oil lubricated guiding catheter biofilm, in order to reduce urinary tract caused
4、 by indwelling catheter infection to provide method and theoretical basis. Methods Preparation of Escherichia coli, MIC two fold dilution methods, drug sensitivity test in vitro, with flat in the silica gel catheter surface of diaphragm after 3D incubation establish biofilm model, and biofilm morpho
5、logy was observed by scanning electron microscope, by quantitative colony counting method to understand this experimental method than the traditional method in decreasing the urinary tract the advantage of using infection; rinse, rinse + ultrasonic 2 methods of dealing with different growth period o
6、f biofilm catheter, by colony counting method to understand the scavenging effect on different period of biofilm and 2 ways of reducing error caused by flushing method. Results Scanning electron microscopic observation of biofilm catheter diaphragm in both bacterial clumps aggregation, shows fibrino
7、id material crosslinking.The results show that the different processing method, the initial in biofilm formation, 2 methods have similar removal effect; but when the biological film tends to be mature, single flushing method is difficult to bring the adhesion of bacteria eluted, 2 methods of the eff
8、ect sequence: Rinse + oscillationwash. Conclusions the catheter biofilm antibiotic pretreatment formation quantity is less, while the control group the number of biofilm formation. Therefore, recommend the use of antibiotic pretreatment of silica catheter, and early in biofilm formation, to catheter
9、s can thoroughly remove flushing of adherent bacteria, biofilm formation in the late, the use of irrigation + effect of ultrasonic oscillation is better.Key words antibiotic pretreatment catheter; Escherichia coli; biofilm; scanning electron microscope; flushing; colony count- -3前言随着现代医学高科技的发展，新型生物材
10、料的应用日益增多，生物材料相关的医源性感染逐年上升。留置导尿是临床上常用的一种操作技术，此技术最常见、最重要的并发症是尿路感染。根据流行病学调查，导尿管相关的泌尿系统感染发生率为 92 93%，约占院内感染的 40% 1。且有资料表明导尿患者菌血症的发生率是非导尿患者的 5.8 倍。目前对减少导尿管表面生物膜的形成进行了多方面的研究，如不同材质导尿管对大肠埃希菌生物膜形成的影响，脂质包被杀菌剂或抗菌药运载体提高药物吸收 2，利用藻酸盐单克隆抗体中和藻酸盐 3，乳铁蛋白结合铁离子使细菌处于移动状态以减少细菌微菌落形成，开发新的生物材料杀菌和抗细菌黏附，纤维素酶降解铜绿假单胞菌胞外多糖 9，抑制
11、QS信号系统类细菌致病因子 4，新型高分子抗菌气管导管对铜绿假单胞菌生物膜形成的体外影响等，此外，研制尿路常见病原菌疫苗 5、发展插管微创技术等亦为预防感染的研究方向。随着留置尿管时间的延长，引起尿路感染的概率也相应的增加 6,7，因此对住院患者，尤其是危重及手术患者已构成较大威胁。留置导尿管细菌生物膜（Bacteria biofiln， BBF）是细菌吸附于生物材料或集体腔道表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白，将自身包裹于其中而形成的膜样复合物。细菌生物膜是导尿管相关尿路感染的物质基础，细菌 BBF 一旦形成，使用正常剂量成百倍药物也不易治愈，所以对 BBF 形成的预防和控制较比生物膜形成
12、后再利用药物抗生物膜更为重要和有效 8。因此现在国内普遍在发生尿路感染后全身使用抗生素的方法对已经形成生物膜的患者往往无效，故提前用抗生素润滑导尿管能有效预防 BBF 形成，运用于临床可以减少由留置导尿管引发的尿路感染问题。抗生素预处理留置导尿管对大肠埃希菌菌所致尿路感染的预防- -4正文1.方法和步骤1.1 方法 试管二倍稀释法，药敏试验，导尿管表面细菌生物膜的建立，电镜观察生物膜，菌落计数。1.2 步骤1.2.1接种菌液准备 将斜面保藏菌大肠杆菌(沈阳医学院实验中心提供)转接到EMB琼脂培养基上，在（371）下培养48h，每天转接1次，试验时应采用连续转接2次后的新鲜细菌（24h内接种）。
13、用接种环从培养基上取少量(刮12环)新鲜细菌，加入培养液中，选择0.5麦氏比浊的菌液浓度作为试验用菌液。1.2.2 药敏试验 用棉签将上一步得到的菌株均匀的涂布在在普通琼脂板上，将平板十字划线，分别在十字的上下左右和中间五个点上放置五种不同的药敏纸片，放在 37温箱中培养 1618 小时后用游标卡尺测定抑菌圈的宽度，选择抑菌圈宽的抗生素作为浸泡导尿管的药物。1.2.3 试管稀释法确定抗生素的最低抑菌浓度（MIC） 取 7 个相同的试管各管分别加入 1ml 已制备的菌悬液和 8ml 的蒸馏水，在第一管中加入 1ml 规格为 40mg/ml 的庆大霉素和 8ml 的蒸馏水，再从第一管中取出 1ml
14、 稀释为相隔 10 倍的浓度梯度(浓度依次为 4000 400 40 4 0.4 0.04ug/ml)及空白对照，从中各取出 2ml 用比浊仪确定MIC 的范围，再以此范围用二倍稀释法确定 MIC。1.2.4 大肠埃希菌生物膜的制备 参照 Brown 平板法将实验组（导管载体浸入 100 倍MIC 的抗生素溶液中 30min9,10）和对照组的导尿管从中剖开用打孔机制备成直径0.7，0.2cm 厚的圆片，高压灭菌后分别放入每孔含有 2ml MH 肉汤的 12 孔培养板中，在各孔内分别加入大肠埃希菌 100 l 用封口膜将平板四周严封以防污染，置于 37孵箱中培养，每 24h 更换培养液（吸出
15、1ml 菌液，加入 1ml 新鲜 MH 肉汤）共培养 3 天。1.2.5 扫描电镜观察 取出培养 18、24、48、72h 导尿管膜片各 1 片，用 0.9%NS 2ml冲洗 5 次，洗掉浮游细菌，置 2.5%戊二醛磷酸缓冲液（PH7.4 左右）中，于 4固定2h，磷酸浸洗液浸洗 3 次，15-20min次，再以 1%锇酸 4固定 2h，磷酸浸洗液浸洗3 次，15-20min次，梯度乙醇脱水，离子喷金镀膜，通过 SEM 进行观察。- -51.2.6 处理生物膜方法 分别在孵育 18、24、48、72h 各取出 6 块膜片，分成 2 组，每组 3 片，分别用以下 2 种方法处理：（1）用 0.9
16、%NS 2ml 冲洗 5 次，收集洗脱液于 20 ml 无菌离心管里。（2） 用 0.9%NS 2ml 冲洗 4 次，置于含 2ml 0.9%NS 的无菌试管中，震荡120R， 15min，收集所有洗脱液（6ml）于 20ml 无菌离心管里。将以上 2 种方法所得洗脱液作菌落计数。上述实验平行重复 3 次。1.2.7 菌落计数的换算 按以下公式算出实际菌落数。实际菌落数（CFUcm 3）=肉眼可计菌落数 稀释倍数 (10000)膜片体积(0.07693cm3) 取实际菌落数的常用对数（l gCFUcm 3）为标准菌落计数单位。1.2.8统计学处理 菌落计数换算为标准菌落计数单位，用SAS8.1
17、统计学软件进行处理。2.结果表 1 不同时间、不同处理方法的生物膜内细菌的对数菌落计数（l gCFUcm 3）34567818h 24h 48h 72h实 验 组 冲实 验 组 冲 +振对 照 组 冲对 照 组 冲 +振实验组 对照组冲洗 冲洗+振荡 冲洗 冲洗+振荡18h（均值） 5.11 5.21 5.43 5.5624h（均值） 5.57 5.73 5.89 5.9748h（均值） 6.28 6.65 6.84 7.4172h（均值） 5.24 5.59 5.88 6.26抗生素预处理留置导尿管对大肠埃希菌菌所致尿路感染的预防- -6图1 不同时间、不同处理方法的生物膜内细菌的对数菌落计
18、数曲线表 2 扫描电镜下生物膜形态实验组 对照组18h24h48h72h- -73.讨论留置导尿是临床常用的侵入性护理操作，是将尿管保留在膀胱内引流尿液的方法，是解决排尿异常、观察尿量的基本手段。导尿管因留置时间长，发生感染的危险性也会增加。导尿管相关尿路感染是长期留置尿管的重要并发症，不但增加了患者经济负担，延长了住院时间，而且消耗了大量的医疗资源。细菌BBF一旦形成，使用抗生素往往无效，因此探讨导尿管引起医院尿路感染的预防措施至关重要。传统导尿方法采用灭菌石蜡油润滑导尿管，而石蜡油必须在干热 160 、2 h 方可达到灭菌效果。干热灭菌一是耗时；二是易受设备、容器、开箱温度等因素影响 ；三
19、是多数基层医院无干热灭菌条件；四是有效期短。因而不能体现现代灭菌学发展的要求有效、快捷、安全。为此，我们用庆大霉素注射液代替石蜡油润滑导尿管具有以下特点： 庆大霉素注射液属油剂，润滑作用与石蜡油无区别； 庆大霉素注射液是静脉用药，绝对无菌，无须另作灭菌处理，且有效期长，方便、经济、安全可靠；庆大霉素注射液属抗生素类药，涂抹导尿管既有润滑作用，又具有抗尿路感染作用，故提前用抗生素润滑导尿管能有效预防 BBF 形成，运用于临床可以减少由留置导尿管引发的尿路感染问题 11,12。我们通过体外平板法在硅胶导尿管膜片表面经过 3d 孵育建立生物膜模型，并用扫描电镜观察生物膜的形态，通过菌落计数法定量了解
20、本实验的方法比传统方法在减少尿路感染上的优势；用冲洗、冲洗+超声振荡 2 种方法处理附有不同生长时期生物膜的导尿管，通过菌落计数法了解 2 种方法对不同时期生物膜的清除效应以及减少由冲洗方法引起的误差，结果从电镜图片中可以看出生物膜生长的动态过程中，实验组比对照组细菌数量明显减少且在孵育第 1824h 增殖较慢，第 4872h 增殖速度较快。由表1 可知实验组在孵化 1824h，菌落对数（l gCFUcm 3）相比，菌落数无显著性差异，但继续孵化至 4872h，2 种处理导尿管的方法所得的菌落数则相互间均有显著性差异。鉴于生物膜内细菌生长的动态规律，设计实验，通过不同方法对黏附大肠埃希菌的导尿
21、管进行处理，比较 2 种方法的优劣。由图 2 的大肠埃希菌生物膜生长动态曲线可知在生物膜形成的初期（24h），冲洗和冲洗+超声振荡 2 种方法处理生物膜，均能较彻底地洗脱黏附细菌，这可能与早期生长细菌菌量较少及黏附不牢固有关；随着生物膜的成熟（48h)，细菌繁殖增多，且粘附牢固，这时单用冲洗方法难于将生物膜洗脱下来，被洗脱下来的菌落数与经超声振荡所得菌落数相比，已明显减少。在后期抗生素预处理留置导尿管对大肠埃希菌菌所致尿路感染的预防- -8（72h)由于生物膜将细菌包裹其中所以两种方法效果均不理想,同时可以看出对导尿管用抗生素预处理比对照组用石蜡油明显细菌数量减少。结果提示，在临床上进行膀胱冲
22、洗预防尿路感染时，在留置尿管早期进行膀胱冲洗，才能有效地达到预防目的。这一结果也为临床选择导尿管及进行膀胱冲洗时间提供了一定的理论依据，当然进一步的证实还须有待于检测藻酸盐（生物膜的主要化学成分）及扫描电镜（SEM）观察微观结构。另外当细菌未粘附至生物材料形成生物膜前，生物材质本身的化学成分对细菌生长繁殖的影响，也关系到最终粘附于生物材质上的细菌数量。由于导尿管引起细菌生物膜形成，导致尿管相关性感染率增高 13,14，国外报道，导尿管相关的泌尿系统感染发生率为92 93%。因此，为了预防导尿管相关性感染，国外目前采用两种对策：(1)预先使用抗菌药物预防。有研究人员采用口服环丙沙星250mg B
23、id和氧氟沙星300mg Bid方案，给予40例将安置输尿管支架的病人，结果发现无1例患者发生菌尿，且输尿管支架上也未检测出，但是提前全身使用抗生素会导致耐药性的增强，对长期住院患者不利。(2)对导尿管材质进行改进。用银相关材料包裹处理导尿管是目前预防尿路感染的主要措施 15，主要方法为用银或银合金、银卵磷脂包裹尿管和用液态银浸渍硅胶和聚亚胺酯(polyurethane)导尿管Eralnger银尿管主要机制都是围绕金属银本身的杀菌作用，研究报道，使用这些材质可以将导尿管相关性UTIS 降低 l1.421，且Erlanger银尿管前景几乎更好，但是昂贵的造价也限制了其广泛应用。大肠埃希菌是比较常
24、见的致病菌，由以上实验可以看出提前预防性的用抗生素润滑导尿管比传统石蜡油能有效的减少大肠埃希菌生物膜的形成，因此，建议选择使用有效期长的庆大霉素作为润滑剂，并且在生物膜形成的初期比成熟后冲洗效果好。- -9参考文献1 Jacobsen SM, Stickler DJ, Mobley HL, et al. Complicated catheter- associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis J. Clin Microbiol Rev, 2008, 21(1)：26-59 .2
25、 Hooton TM. International clinical practice guidelines for the diagnosis, prevention and treatment of catheter-associated urinary tract infection in adults R. 48th Annual ICAAC/1DSA 46th Annual Meeting, Washington, 2008, 17(13)：25-28.3 王睿，裴婓，柴栋，等.抗藻酸盐血清与加替沙星联合对铜绿假单胞菌生物被膜形态的影响 J. 中华医学杂志， 2009，82(18)：
26、1276 .4 Webb JS, Thompson LS, James S, et al. Cell death in Pseudononasaeruginosa biofilm development J. Bacteriol, 2003, 185(15)：4585-4592.5 Jones MN. Use of liposomes to deliver bactercides to bacterial biofilms J. Methods Enzymol, 2005, 391(9)：211-228.6 李毅萍，谢艳华，郭健凌，等.导尿管相关尿路感染的原因分析及对策 J. 中华医院感染学杂志，2009，19(23)：3204-3206.7 陈波曼，加林 .细菌生物膜形成和耐药机制研究进展 J. 中国抗生素杂志，2005， 30(10)：641-644.8 顾金华，杨荣华，姚中民，等 .留置导尿管表面生物膜细菌学检测的临床价值 J. 中华医院感染学杂志，2010，13(9)： 814-816.9朱元元.呋喃西林涂层导尿管的制作方法及药物缓释效果研究 J. 中华医院感染学杂志，2012，22(15)：3281-3283.
