1、1选修 3现代生物科技专题专题 1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望（定向变异），进行严格的设计，通过 体外 （体内、体外）DNA 重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物 类型 和生物 产品 。基因工程是在 分子 水平上进行设计和施工的，又叫做 DNA 重组 技术 。基因工程技术的原理： 基因重组 基因工程的优点：（1）目的性强，能够定向的改变生物的品质。（2）克服远缘杂交不亲和。1.1 基因工程的基本工具1.“ 分子手术刀 ” 限制酶（全称：限制性核酸内切酶）（1）主要来源： 原核生物 。（2）功能：能够识别双链 DNA 分子的某种 特定 的
2、核苷酸序列（被识别序列具反向对称特点），并且使每一条链中 特定 部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键 断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式： 黏性 末端和 平 末端。（4）与解旋酶的区别：解旋酶：断开碱基对间 氢键 限制酶：断开两个脱氧核苷酸之间（即磷酸与脱氧核糖之间）的 磷酸二酯键 2.“ 分子缝合针 ” DNA 连接酶(1)两种 DNA 连接酶（Ecoli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶）的比较：相同点：都连接 磷酸二酯 键。区别：EcoliDNA 连接酶来源于 T4噬菌体，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来
3、；而 T4DNA 连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。(2)与 DNA 聚合酶作用的异同:DNA 聚合酶：只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA 连接酶：连接两个 DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键。3.“ 分子运输车 ” 运载体（1）运载体具备的条件：具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA 片段插入。能在受体细胞中复制并稳定保存。具有标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择。能在受体细胞中稳定保存（对受体细胞无害），大小合适。（2）最常用的载体是 质粒 ,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的很小的双链 环状 DNA
4、分子。（3）其它载体： 噬菌体的衍生物 、 动植物病毒 。2（4）在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。1.2 基因工程的基本操作程序步骤：1、 获取目的基因 ， 2、 基因表达载体的构建 ，3、 将目的基因导入受体细胞 ， 4、 目的基因的检测和鉴定 。第一步：获取目的基因1.目的基因范围：编码蛋白质的基因、具有调控作用的因子。2.目的基因来源：自然界获得或人工合成自然界获得：采取直接分离法-用适当的限制酶处理得到。工作量大，多为原核基因来源。人工合成： 反转录法 和化学合成法。操作复杂，基因结构不完整，多为真核基因的来源。补：基因结构原核基因、
5、真核基因均有两种区域： 编码区 、 非编码 。但真核基因的前者是不连续的，分为 外显子 和 内含子 。3.目的基因的（大量）获取方法（1）从基因文库获取A.基因文库分类：基因组文库、 部分基因文库 B.获取方法：据 目的基因 的有关信息，以及基因的表达产物蛋白质等特性。C.两种文库中目的基因的来源：基因组文库的目的基因来源于 自然界直接分离法获得 。cDNA 文库的目的基因来源于 反转录法人工合成 。D.两种文库中目的基因的区别：书 P10 表格（2）PCR( 多聚酶链式反应 的缩写)技术.(发明人：穆里斯等人)A.原理： DNA 双链复制 B.特点： 体外 复制， 指数 增加， 需要 （需要
6、、不需要）模板。C.过程：第一步：高温解链（变性）：加热至 9095，双链 DNA 受热解成单链（不需解旋酶）；第二步：低温引物（复性）：冷却到 5560，引物与模板单链 DNA 互补结合；第三步：中温复制（延伸）：加热至 7075，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成。第四步：重复一至三步。D.所需条件：模板为 目的基因 ，原料为 四种脱氧核苷酸 ，酶为 热稳定 DNA 聚合酶 ，能量由 ATP 直接提供。（3）化学合成法人工合成（通过 DNA 合成仪）特点：A. 基因较小 B. 核苷酸序列已知 C. 不需模板 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：将目的基因导入受体细胞，并使目的基
7、因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代（复制），使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成： 目的基因 启动子终止子 标记基因 。（具复制原点）3（1）启动子：是一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端（编码区上游的非编区），含有 RNA 聚合酶识别和结合的位点，有助于 RNA 聚合酶驱动基因的编码区转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的 DNA 片段 ，位于基因的尾端（编码区下游的非编区）。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因，此外还有荧光蛋白基因。第三步：将目的基因
8、导入受体细胞1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化 （该方法主要针对 双子叶植物 植物和 裸子 植物，而对大多数 单子叶 植物无效。利用农杆菌 Ti 质粒上的 T-DNA 可整合到受全细胞染色体DNA 上的特性）。其次还有 基因枪法 （又称微弹轰击法），以及 花粉管通道 等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射法 。此方法的受体细胞多是 受精卵 。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 。最常用的原核细胞是 大肠杆菌
9、 ，其转化方法是：先用 钙离子 处理细胞，使其成为感受态细胞 ，再将重组表达载体 DNA 分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA 分子，完成转化过程。3.重 组 细 胞 导 入 受 体 细 胞 的 成 功 率 很 低 ， 需 利 用 标 记 基 因 筛 选 含 有 基 因 表 达 载 体 受体 细 胞 。第四步：目的基因的检测和鉴定 1.分子水平的检测（1）首先要检测 转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因方法/技术： DNA 分子杂交技术 基因探针：用放射性同位素或荧光分子等标记的 目的基因 单链。检测对象：DNA 存在标志：出现杂交带。（2）其
10、次还要检测 目的基因是否转录出了 mRNA方法/技术： DNA 分子杂交技术 基因探针：用放射性同位素或荧光分子等标记的 目的基因 单链。检测对象： mRNA 。 存在标志：出现杂交带。（3）最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质方法/技术： 抗原-抗体杂交 存在标志：出现杂交带。目的基因翻译成的蛋白质相当于 抗原 。 2.个体生物学水平的鉴定4如做抗虫的接种实验： 将虫子放在转基因植物上，观察虫子是否因摄食植物死亡 ，以确定转基因抗虫植物是否出现抗虫性状及抗性的程度。又如，有的基因工程产品需与天然产品的功能进行 活性 比较，以确定转基因产品的 功能活性 是否与天然产品相同。1.3 基因工程的应用
11、注意：书中提到的各种应用中，目的基因为何？1.植物基因工程应用：（1）抗虫、抗病等抗逆能力的提高。（2）改良农作物的品质。（3）利用植物生产药物等。2.动物基因工程：（1）提 高 动 物 生 长 速 度 。 （ 2） 改 善 畜 产 品 品 质 。 （ 3） 用 转 基 因 动 物 生 产 药 物 。 （ 4） 器 官 移 植的 供 体乳腺生物反应器（乳房生物反应器）： 药用基因 （目的基因）+ 乳腺蛋白基因的启动子3.基因工程药物（干扰素是一种 糖蛋白 。）工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系一般称为工程菌。4.基因治疗：把 正常 的外源基因导入病人体内，使该基因
12、表达产物发挥作用。是治疗遗 传病的最有效的手段。5.基因芯片的应用（DNA 分子杂交技术）：亲子鉴定、罪犯认定、尸体辨别、疾病诊断等。1.4 蛋白质工程1、蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以 蛋白质的结构规律 及 其与生物功能的关系 作为基础，通过 基因修饰或基因合成 ，对现有蛋白质进行 改造 ，或制造一种新的（自然界没有的）蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。是在 基因工程 的基础上延伸出来的。（基因工程在原则上只能生产 自然界已存在 的蛋白质）2、过程预期蛋白质功能-设计蛋白（空间）结构-改造相关基因-基因工程实现预期3.进展成功例子不多，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级（空间
13、）结构，而目前科学家们对此了解的还很不够。 专题 2 细胞工程5细胞工程：是指导应用 细胞生物 学和 分子生物 学的原理和方法，通过 细胞 水平或 细胞器 水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术，根据操作对象不同分为：植物细胞工程，动物细胞工程操作水平： 细胞 水平的操作（基因工程为 分子 水平的操作）2.1 植物细胞工程 （属于无性繁殖）有关知识回顾：1、无性繁殖最大优点：保持优良品种的遗传特征。2、理论基础（原理）：细胞全能性（具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞都具有发育成完整生物体的潜能，也就是说，每个生物细胞都具有全能性的特点，）3、具有全
14、能性的原因：分化的细胞，仍具有形成完整植株所需要的全部基因。理论上，生物的任何一个细胞都具有发育成完整植物的潜力，但是在生物的生长发育过程中，细胞并不会表现出全能性，而是分化成各种器官和组织，是因为在特定的时间和空间条件下，基因选择性表达的结果。4、全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞； 植物细胞动物细胞一、植物细胞工程的基本技术：植物组织培养，植物体细胞杂交技术（一）植物组织培养技术（最基本技术）1.原理： 细胞全能性 2.过程：离体的植物器官、组织或细胞 （ 脱分化 ） 愈伤组织 （再分化） 胚状体 植物体（外植体消毒） 生长素及细胞分裂素 生长素及细胞分裂素 （试管苗）（避光
15、） （给光）植物全能性表达的条件：离体的，提供人为条件（营养，激素，适宜的外界条件）愈伤组织：细胞排列疏松而无规则是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞3.注意事项（1）材料： 离体 、 消毒 、 分化程度较低 （2）环境： 无菌、避光给光 （3）培养基：含有：无机营养（水、无机盐），小分子有机物， 植物激素 ，维生素。固体培养基（琼脂），4.地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。是植物细胞工程的最基本技术（二）植物体细胞杂交技术（1）过程：原生质体制备 细胞融合6杂种细胞筛选 细胞培养（组织培养技术） 植物鉴定 植物再生要点：A.去细胞壁：纤维素酶和果胶酶B.
16、诱导融合的方法：物理法包括 离心、振动、电激 等。化学法：用聚乙二醇（PEG)作为诱导剂。C.杂种细胞形成标志：再生出 细胞壁 。（2）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。打破特种之间的生殖隔离，扩大遗传重组范围。2、植物细胞工程的应用：探究植物科学理论的重要手段，微型繁殖、培养脱毒苗、生产人工种子、培养新品种（单倍体育种）、转基因植物的培养，细胞产物的工厂化生产。要点：1、微型繁殖的优点：可以保持优良品种的遗传特性，可以高效快速地实验种苗的大量繁殖2、人工种子的优点：无性繁殖，完全保持优良品种的遗传特性，不受季节限制，方便运输及贮藏3、单倍体育种的优点：极大缩短了育种的年限，节约了大量的人力物
17、力。2.2 动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养（基础技术），动物细胞核移植，动物细胞融合（生产单克隆抗体）。1. 动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。（2）原理： 细胞增殖（有丝分裂） （3）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞后分瓶，进行传代培养。细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目
18、不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。（4）动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常还需加入血清、血浆等天然成分。含有天然成分的培养基称天然培养基。温度：适宜温度：哺乳动物多是 36.50.5；pH：7.27.4。7气体环境：9 5%空 气 5%CO2。 O2是 细 胞 代 谢 所 必 需 的 ， CO2的 主 要 作 用
19、 是 维 持 培 养 液 的 pH。（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。2.动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。（2）体细胞核移植的大致过程是：（下图）（3）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母 )细胞 比较大，容易操作；卵(母 )细胞 细胞质多，营养丰富；细胞质中合成与分裂分化有关的物质能刺激融合后重组细胞进行分裂分化。（4）体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育； 保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白； 作为异种移植的供体；用
20、于组织器官的移植等。（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。3.动物细胞融合（1）定义：动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（2）原理：动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同：细胞膜的流动性（3）方法：诱导动物细胞融合方法的与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。（4）意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。（5）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：比
21、较项目 细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段 用法植物体细胞杂交细胞膜的流动性、植物细胞的全能性去除细胞壁后诱导原生质体融合物理：离心、电刺激、振动，化学：聚乙二醇等试剂诱导克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株动物细胞融合细胞膜的流动性使细胞分散后诱导细胞融合除应用植物细胞杂交手段外，还可利用灭活的病毒诱导制备单克隆抗体的技术之一84.单克隆抗体（1）抗体：一个 B 淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（2）单克隆抗体的制备过程：（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（5）单
22、克隆抗体的作用： 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。专题 3 胚胎工程胚胎工程：是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。胚胎工程的许多技术，实际是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。（一）体内受精和早期胚胎发育1、精子的发生（1）场所：睾丸（精巢） （2）时间
23、：初情期-生殖机能衰退（3）阶段： （4）精子的外形：似蝌蚪，分头，颈，尾三部分。不特定抗原9同动物精子形态相似，大小与动物的体型大小无关。（5）变形：细胞核-精子头的主要部分高尔基体-顶体 中心体-尾部 线粒体-鞘膜 其它物质-原生质滴-脱落2、卵子的发生（1）场所：卵巢 （2）时间：性别分化以后（胎儿期）-精子与卵子在发生时间上的差别是重要的区别减数第一次分裂是在雌性动物排卵前后完成的，其结果产生一个次级卵母细胞和第一极体，进入输卵管，准备与精子受精（不同的动物排卵的时间不同）。排卵是指卵子 卵泡 从中排出。减数第二次分裂是在精子和卵子结合的过程中完成的，当卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两
24、个极体时，说明卵子已经完成了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志。（3）过程103、受精：（1）场所：雌性的输卵管内（2）过程：准备阶段：精子 获能：刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力卵子的准备：动物排出的卵子成熟程度不同，但都在要输卵管内进一步成熟，达到减数第二次分裂的中期，才具备与精子受精的能力。受精阶段：获能的精子通过 顶体 反应依次穿过 放射冠、透明带，精子的头部与卵细胞膜，即卵黄膜接触，引发防止多精入卵的第一道屏障：透明带反应。两个细胞的细胞膜融合，引发第二道屏障卵黄膜封闭作用。同时卵子开始继续减数第 二次分裂，因此，此时可观察
25、到受精作用的标志，即精子入卵的标志：在透明带和卵黄膜之间观察到两个极体;精子入卵后，形成雄原核，同时卵细胞形成雌原核。雌雄原核的融合标志着受精作用完成。4、动物胚胎发育的基本过程（1）卵裂期：细胞有丝分裂，细胞数量不断增加。胚胎中有机物种类增加，DNA 数目增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。每个细胞体积变小。细胞 未分化 （2）桑椹胚：胚胎细胞数目达到 32 个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。细胞 分化，是全能细胞。（3）囊 胚：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。（4）原肠
26、胚：特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。胚胎发育（受精卵幼体）后，生物体进行胚后发育（胎儿-性成熟）植物是从受精卵-种子，胚后发育从种子-开发结果（二）体外受精和早期胚胎培养1 体外受精主要过程包括：卵母细胞的采集，精子的获取，和受精(1)卵母细胞的采集和培养：主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。(2) 精子的采集和获能：假阴道法，手握法和电刺激法，在体外受精前，要对精子进行获能处理。培养法和化学诱导法两种（把精子放在人工配制的获能液中如肝素中）(3) 受精：获 能 的 精 子 和 培 养 成 熟 的 卵 细 胞 在 获 能 溶 液 或 专 用 的 受 精 溶 液 中 完 成 受 精 过 程 。(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑
