1、RNA干扰文库及其应用 RNAi的概况 SiRNA类型 RNAi文库（ RNAi library) RNAi文库的分类 RNAi文库的构建策略 RNAi文库在功能基因组研究中的应用 RNAi library技术需要注意的问题RNAi概况 RNAi(RNA interference ， RNA干扰 )： 短双链 RNA（ dsRNA） 诱导靶基因 mRNA特异性降解，或阻止 mRNA翻译，产生基因沉默（ gene silence)的现象。因此，又称为 knockdown。 1995年，康乃尔大学 的 Su Guo用反 义 RNA技术抑制 par-1基因时，意外发现正义 RNA（ sense RN
2、A） 也能抑制 C. elegans par-1基因表达。 1998年， Andrew Fire和 Craig Mello揭示正义 RNA抑制基因表达是由于混有双链 RNA。 RNAi现象普遍存在动植物体内。发现植物中的 21-25nt的 RNA分子诱导 PTGS（ post-transciption gene silence， 转录后基因沉默） 。 2001年， Emily等在果蝇中确定了降解 dsRNA的关键酶，并命名为 Dicer， 此酶属于RNaseIII家族，在进化上保守。 SiRNA的类型 寡核苷酸 SiRNA： 人工合成、体外转录o 特点：易于设计、合成昂贵、瞬时表达 吗啡啉核苷
3、 SiRNA： 人工合成 RNA类似物。o 特点：结合力强，不易降解，效率高 载体表达 型 SiRNA（ 细菌质粒、病毒载体）：基于表达载体在细胞内表达。o 特点：稳定表达、可大量扩增，转染效率低，操作繁杂RNAi的 机制 细胞自然存在二种干扰 RNAo siRNA（ 短干扰 RNA）： 19-25nt， 由长dsRNA裂解而成的小片段，诱导 mRNA降解。 o microRNA(miRNA) ： 22nt， 呈短发夹结构（ short hairpin RNA， shRNA）， 由miRNA前体酶解而成，抑制 mRNA翻译。线虫晚期miRNA的形成早期胚胎发育过程中miRNA参与细胞分化病毒或基因重组siRNA的形成及作用RNAi 的基本过程： siRNA形成： dsRNA被 Dicer酶剪切成 siRNA，消耗能量； RISC（ RNA-induced silencing complex） 形成： 与 RNAi辅助蛋白 argonaute家族分子、 RNA依赖性聚合酶结合形成 RISC， 消耗 ATP能量； RISC 活化： siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式； 阻止翻译或诱导 mRNA降 解： 在 siRNA引导下，RISC识别并切割互补的 靶 RNA， 无需或消耗少量 ATP。
