1、小麦花药培养后代和杂交后代中高分子量麦谷蛋白亚基变异分析韩晓峰 1,2，叶兴国 1,，刘晓蕾 1,3，魏亦勤 4，杜丽璞 1，王 轲 2，佘茂云 1，樊 明 4，晏月明 2,（ 1 中国农业科学院作物科学研究所/国家基因资源与基因改良重大科学工程/农业部作物遗传育种重点实验室，北京 100081； 2 首都师范大学生命科学学院，北京 100048； 3 北方民族大学生命科学与生物工程学院，银川 750021； 4 宁夏农林科学院农作物研究所，永宁 750105）摘要：通过对 Alondra、Orofen 等 5 个小麦品种进行花药培养，同时 以新春 9 号、京 771、CB037 等 9 个高
2、分子量麦谷蛋白亚基组成不同的小麦品种相互间配制 24 个正、反交组合，分析小麦加倍单倍体无性系和品种间杂交后代中高分子量麦谷蛋白亚基（High molecular weight glutenin subunits, HMW-GS）变异，探讨利用花药培养和杂交手段改良 HMW-GS 组成的可能性。SDS-PAGE 电泳分析发现，小麦加倍单倍体无性系中 HMW-GS 发生了频繁变异，Alondra 加倍单倍体中变异率最高（61.8%） ，Verry 加倍单倍体次之（ 16.7%） ，均出现了原始材料中所不具备的亚基类型；HMW-GS 在部分 F1 杂种中呈现不完全共显性、亚基表达沉默和正、反交亚基
3、表达不一致现象，宁春 4 号/CB037、京 771/宁春 4 号 2 个组合中出现了双亲所不含有的亚基；通过连续自交和对新出现亚基的跟踪选择，获得了表达新亚基的高代株系。研究结果对于改良小麦加工品质，加深了解小麦 HMW-GS 编码基因的遗传特性、结构特性等具有一定理论意义和实践价值。关键字：小麦；高分子量麦谷蛋白亚基；花药培养；无性系变异；SDS-PAGEComposition Variation of High Molecular Weight Glutenin Subunits in the Doubling Haploids from Anther Culture and the C
4、rossing Hybrids in WheatHAN Xiao-fen1,2, YE Xing-guo1, LIU Xiao-lei1,3, WEI Yi-qin4, DU Li-pu1, WANG ke2, SHE Mao-yun1, FAN Ming4, and YAN Yue-ming2(1 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 College of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing
5、100048; 3 College of Life Sciences and Biology Engineering, North University for Ethnics, Yinchuan, Ninxia 750021； 4 Crop Research Institute, Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Yongning, Ningxia 750105)Abstract: High molecular weight glutenin subunits (HMW-GS) in the doubling hap
6、loids from five stable cultivars and in the twenty-four crossing hybrids between ninet different varieties in common wheat were analyzed by SDS-PAGE to explore the possibility of improving the subunit compositions by anther culture and commercial crossing. The results f indicated that frequent varia
7、tion of HMW-GS happened in the doubled haploids with a rate up to 61.8% in the genotypes tested, and several subunits might be new ones which are not present in the corresponding wild types, but need to be identified further. In most F1 hybrids, the expression of all HMW-GS appeared to be co-dominan
8、t, but the expression of one or two HMW-GSs was did found to be suppressed in a few F1 crosses. Cytoplasm of female parents was found to have some effect on the expression of very few subunit in a few crosses. At the same time, 2-3 possible new subunits that did not exist in the parents were observe
9、d in the two crosses, Ningchun4/CB037 and Jing771/Ningchun4. By continuous self-crossing and tracing of the new subunits, stable lines expressing the putative new subunits were obtained from the two crosses mentioned above. The present study is theoretical and practical valuable for the improvement
10、of wheat quality and the further understanding of the genetic and structural features of HMW-GSs encoding genes.Key words: Triticum aestivum; High molecular weight glutenin subunits; Anther culture; Somatic variation; SDS-PAGE麦谷蛋白（Glutenin ）是小麦储藏蛋白的主要组成成分，包括高分子量麦谷蛋白亚基(High molecular weight glutenin
11、subunits, HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(Low molecular weight glutenin subunits, LMW-GS)二类，约占子粒蛋白的 35%45% 1-3。高分子量麦谷蛋白亚基由 Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1 三个位点编码，分别位于 1AL、1BL 、1DL 染色体上 4-7；低分子量麦谷蛋白亚基由 Glu-A3、Gl收稿日期：2010-05-14 修回日期：2010-07-28基金项目：国家自然科学基金(30830072)；宁夏农业厅重点合作项目资助作者简介：韩晓峰，硕士研究生。E-mail：通讯作者：晏月明，博士，教授。E-mail：；叶
12、兴国，博士，研究员。E-mail：u-B3、Glu-D3 三个位点编码，分别位于 1AS、1BS 、1DS 染色体上 6-8。高分子量麦谷蛋白亚基等位基因变异主要影响面筋强度，后者关系到面包和面条的加工品质及商业价值 9-13。研究表明，HMW-GS 由复等位基因控制，每个染色体上的 2 个基因紧密连锁，如同一个孟德尔遗传单位 4，13 。常规杂交能使 HMW-GS 编码基因聚合在同一基因组中，HMW-GS 基因在 F1 代表达存在剂量效应，即双亲的全部亚基呈共显性遗传，在 F2 代的遗传符合孟德尔独立分配及自由组合规律，并带有母性遗传现象 15-16。并且，Glu-1 位点的复等位基因在 F
13、1 代子粒中两两共同存在时，无正反交区别，也无显隐性可言17。组织培养过程中由于培养基中化学成分的作用，可诱发培养物中激活子、解离子的活性，从而产生基因变异，以及染色体结构变异 18。胡含等发现小麦花粉植株在形态上及染色体数目上存在变异，初步解释了小麦花粉无性系变异具有普遍性的原因 19。本课题组 90 年代利用花药培养技术对几个定型品种进行了无性系诱导，发现了加倍单倍体在株高、穗长、粒重等农艺性状上存在变异 20。目前，还没有在小麦杂交后代中发现超越双亲 HMW-GS 亚基组成及正、反杂交组合中 HMW-GS 亚基组成不同的现象，也没有关于花药培养后代中 HMW-GS 亚基组成发生变异的报道
14、。为此，我们对 Alondra、Orofen、Verry 等小麦品种进行花药培养，培育出足够数量的加倍单倍体，采用SDS-PAGE 对加倍单倍体进行电泳分析；利用新春 9 号、京 771、CB037、中国春、宁春 4 号、Bobwhite、扬麦 12 号、京冬 8 号等 HMW-GS 亚基组成不同的小麦品种相互间配制正交和反交组合，利用 SDS-PAGE 对杂交当代子粒及后代子粒 HMW-GS 亚基组成进行电泳分析；发现 HMW-GS 亚基组成在加倍单倍体后代和自交后代中均存在变异，而且在一些正、反杂交组合中存在差异，这对于小麦品质性状的基础理论研究和育种实践具有一定意义。1 材料与方法1.1
15、 小麦材料小麦材料 Verry、Alondra 、Orofen 和百农 3217（BN3217）由国家作物种质资源保存中心提供，京 771（J771） 、中国春（CS） 、中优 9507（ZY9507） 、新春 9 号（XC9） 、CB037 、宁春 4 号（NC4） 、Bobwhite、扬麦 12（YM12） 、WM151A、石 4185（S4185 ）和京冬 8 号（JD8）由本课题组收集保存。其中，Verry、Alondra 、Orofen、新春 9 号和百农 3217 用于花药培养，获得加倍单倍体群体；京771、CS 、新春 9 号，CB037、宁春 4 号、Bobwhite、扬麦 1
16、2、京冬 8 号和石 4185 用于配制杂交组合，相互间共制了 24 个正、反交组合；京 771、CS 和中优 9507 作为高分子量麦谷蛋白亚基分析的标准对照品种。1.2 花药培养孕穗期取小孢子发育处于单核靠边期的小麦幼穗，置于 4冰箱中处理 3 d21，接种前用 75%乙醇表面擦拭消毒，无菌条件下取出花药接种在 W14 附加 2.0 mg/L 2,4-D、10%蔗糖和 8 g/L 琼脂（pH 6.0）固体培养基上，28、黑暗条件下培养 3040 d 诱导愈伤组织。将直径 1 mm 左右大小的愈伤组织转移到 1/2 MS 附加 1.0 mg/L KT、0.5 mg/L NAA、2%蔗糖、8
17、g/L 琼脂培养基（pH 6.0）上，25、63 mol/m2s 光照件下培养 2030 d 分化植株。将再生芽进一步转移到 1/2 MS 附加 0.5 mg/L IAA、1.0 mg/L 多效唑、2% 蔗糖、8 g/L 琼脂培养基（pH 6.0）上壮苗和生根培。移栽前用清水将根系上的培养基清洗干净，将根系健壮的绿苗移入温室 20。1.3 麦谷蛋白提取单粒风干种子在-80液态氮中充分研碎，加入 1ml 70%乙醇，涡旋振荡 30 min，12000 rpm 离心 10 min,弃上清后干燥；加入 1ml 55%异丙醇，混匀并涡旋， 65水浴 30 min，12000 rpm 离心10min，充
18、分干燥；加入 120 l 溶液 B（50% 异丙醇+0.2M Tris-HCl pH 8.0，新鲜加入二硫苏糖醇 DTT达 1%） ，混匀涡旋，放入 65水浴 30 min；加入 100 l 溶液 B（50% 异丙醇+0.2M Tris-Hcl，pH 8.0，加入 4-乙烯吡啶达 1.4%，涡旋混匀；65水浴 30 min，12000 rpm 离心 10 min；上清液转入新离心管，12000 rpm 离心 10 min，吸取 100 l 上清液转入新离心管，加入等体积的 Glu-buffer（20%SDS；0.02%溴酚兰；0.08M Tris-HCl pH 8.0；40% 甘油）,65水浴
19、 30 min，12000 rpm离心 10 min22。1.4 SDS-PAGE先配制 12%的分离胶，凝聚一个小时后灌入 10%的浓缩胶，插入梳子后再凝聚一个小时以上用做电泳。上样量为 610 l/孔，稳流 15 mA/gel 20 min 后，稳流 20 mA/gel，电泳 2.54 小时后将胶放入SDS 染色液（0.1%考马斯亮蓝 R-250,45%乙醇，10% 冰乙酸）中，过夜染色。倒掉染色液，加入SDS 脱色液（10乙醇，10冰乙酸） ，在摇床上脱色 23 次，在胶片观察灯上看到清晰的蛋白条带时用凝胶扫胶仪（清华紫光 e100）扫描保存 23。1.5 主要农艺性状调查加倍单倍体和对
20、照品种 2009 年 2 月种植在宁夏农林科学院农作物研究所试验基地，生育期间调查出苗期、抽穗期和成熟期，收获前每个材料随即取 10 株调查株高、穗粒数，脱粒后测定千粒重、粒色等主要农艺性状。2 结果与分析2.1 加倍单倍体植株获得以 5 个小麦基因型 Verry、Alondra、Orofen、新春 9 号、百农 3217 为材料进行花药培养，其中，接种 Verry 花药 3882 枚，诱导出愈伤组织 1054 块，获得可育株 42 株，出愈率为 27.2%，加倍率28.4%；接种 Alondra 花药 924 枚，诱导出愈伤组织 317 块，获得可育株 40 株，出愈率 34.3%，加倍率为
21、 35.1%；接种 Orofen 花药 1860 枚，诱导出愈伤组织 234 块，获得可育株 29 株，出愈率为12.6%，加倍率为 29.6%；接种新春 9 号花药数 2540 枚，诱导出愈伤组织 435 块，获得可育株 21 株，出愈率 17.1%，加倍率 29.6%；接种百农 3217 花药数 11081 枚，诱导出愈伤组织 43 块，获得可育株2 株，出愈率 0.4%，加倍率 40.0%（表 1） 。表 1 不同小麦基因型花药培养获得加倍单倍体情况Table 1 Callus induction and plantlet induction directly from wheat an
22、thers in different media基因型Genotypes花药数Anthers inoculated愈伤组织数Callus number愈伤组织诱导率（%）Percentage of calli不育株Sterile plants可育株Fertile plants 加倍率(%)Doubling frequencyVerry 3882 1054 27.2 106 42 28.4Alondra 924 317 34.3 74 40 35.1Orofen 1860 234 12.6 69 29 29.6新春 9 号 2540 435 17.1 50 21 29.6百农 3217 1108
23、1 43 0.4 3 2 40.02.2 加倍单倍体高分子量麦谷蛋白亚基变异分析对 Alondra 花药培养获得的 40 个株系进行 SDS-PAGE 分析结果表明，在其中的 21 个株系中高分子量麦谷蛋白亚基组成出现了变异（图 1） ，变异率为 52.5%。进一步以对照品种中优 9507（HMW亚基组成为：1，7+9，5+10 ） 、京 771（HMW 亚基组成为：1，17+18，5+10）和中国春（HMW 亚基组成为：Null，7+8 ，2+12）为参照，分析 Alondra 加倍单倍体高分子量麦谷蛋白亚基组成，发现其变异主要分为二类，第一类与中优 9507 类似，亚基组成可能为（1，7+
24、9，5+10） ；第二类与中国春类似，亚基组成可能为（Null ，7+8，2+12） 。这二类变异中也可能有新亚基，需要进一步鉴定。1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 22 23 24 25 26 27 28 29 30图 1 Alondra 加倍单倍体高分子量麦谷蛋白亚基组成分析Fig. 1 HMW-GS composition analysis of the doubling haploids derived from Alondra1-4，6-10，11，13-20，21-24，26-30：Alondra 加倍单倍体；5
25、，12，25：Alondra对 Verry 花药培养获得的 42 个株系的 SDS-PAGE 分析结果表明，在其中的 7 个株系中高分子量麦谷蛋白亚基组成出现了变异（图 2） ，变异率为 16.7%。以标准品种中优 9507（1，7+9，5+10） 、京 771（1，17+18 ，5+10 ）和中国春（Null ，7+8，2+12）为参照辨别高分子量麦谷蛋白亚基组成。结果表明，Verry 花培无性系高分子量麦谷蛋白亚基组成发生了稳定性变异，主要分为二类，第一类与中优 9507 类似，第二类属于一种新类型，亚基组成可能为（Null，7+18，5+10） 。也可能出现了新亚基，有待进一步分析。1
26、2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16图 2 Verry 加倍单倍体高分子量麦谷蛋白亚基组成分析Fig. 2 HMW-GS composition analysis of the doubling haploids derived from Verry1，11：中优 9507；2：:京 771；3，12：Verry ；4-10，13-15 ：Verry 加倍单倍体；16：中国春对百农 3217 花药培养获得的 2 个株系的 SDS-PAGE 分析结果表明，在这 2 个株系中高分子量麦谷蛋白亚基组成比百农 3217 多了一条带（图 3） ，与 1 号亚基类似，推
27、测其亚基组成为（1，7+8，2+12） ，可能有新亚基出现。由于获得的加倍单倍体较少，变异情况有待进一步研究。1 2 3 4 5 6图 3 百农 3217 加倍单倍体高分子量麦谷蛋白亚基变异分析Fig. 3 HMW-GS composition analysis of the doubling haploids derived from Beinong32171：中优 9507；2：京 771；3：Alondra；4：百农 3217；5-6：百农 3217 加倍单倍体同样，对新春 9 号 21 个加倍单倍体株系和 Orofen 29 个加倍单倍体株系子粒中的麦谷蛋白进行SDS-PAGE 分析。
28、结果表明，这 50 个加倍单倍体分别与对照品种新春 9 号和 Orofen 相比，高分子量麦谷蛋白亚基组成没有发生变异。2.3 典型 HMW-GS 组成变异加倍单倍体主要农艺性状加倍单倍体主要农艺性状调查结果显示，HMW-GS 组成发生变异的加倍单倍体在株高、生育期、子粒颜色等主要性状上与对照品种一致（表 2） ，穗粒数比相应对照略有减少，千粒重比相应对照略有提高。表明典型 HMW-GS 变异加倍单倍体的主要植物学性状与对照基本一致，在有关品质性状的HMW 组成上发生了变异。表 2 部分 HMW-GS 组成变异加倍单倍体农艺性状Table 2 Main agronomic characteri
29、stics of some haploids with variation in HMW-GS composition材料编号Material name or ID株高(cm)Plant heightt生育期(d)Growth period穗粒数Grains per spike穗粒重(g)Grain weight per spike千粒重(g)1000 grains weight子粒颜色Grains colorVerry(CK) 94 101 43.7 2.4 40.1 红1043-Ve-3 95 101 39.5 2.3 48.6 红1048-Ve-8 93 101 43.5 2.0 39.
30、6 红1055-Ve-35 90 101 42.8 2.6 41.0 红Alondra(CK) 98 101 42.1 2.7 43.2 红1098-Al-7 97 101 39.4 2.6 47.6 红1110-Al-31 98 101 36.0 2.7 48.2 红1122-Al-38 98 101 36.3 2.7 46.3 红2.4 不同杂交组合中高分子量麦谷蛋白亚基表达和变异分别用京 771、CS、新春 9 号、CB037、宁春 4 号、Bobwhite、扬麦 12、京冬 8 号和 WM151A等品种配制正、反杂交组合，对 F1 杂种子粒中的高分子量麦谷蛋白进行 SDS-PAGE 分
31、析（图 4） 。结果表明，新春 9 号/Bobwhite 组合和 Bobwhite/新春 9 号组合中含有双亲所有亚基(1+2，7+9，5+10)，表现为共显性表达，正、反杂交组合中亚基相同。宁春 4 号/ 京冬 8 号组合中含有双亲的所有 9 个亚基(1，7+9+17+18，2+12+5+10) ，表现为共表达。宁春 4 号/WM151A 组合中含有双亲宁春 4 号和WM151A 中全部 7 个亚基(1 ， 7+9，17+18，5+10)，所有亚基表现为共表达。宁春 4 号/新春 9 号组合中含有双亲的 7 个亚基(1，7+9+17+18，5+10)，表现为共表达。京 771/CS 组合中含
32、有双亲的 8 个亚基(1，7+8+17+18，2+5+10) ， CS 最小亚基（12）被抑制，其他亚基表现为共表达。京 771/新春 9 号组合和新春 9 号/京 771 组合中只含有京 771 的 5 个亚基(1，17+18，5+10)，新春 9 号中的 2 个亚基（7+9）被抑制，正、反杂交组合中亚基表现相同。CS/ 宁春 4 号组合和宁春 4 号/CS 组合含有双亲的8 个亚基(1 ，7+8+17+18，2+12+5+10) ，CS 最小亚基（12）被抑制，其他亚基表现为共表达，正、反杂交组合中亚基表达相同。CS/ 新春 9 号组合和新春 9 号 /CS 组合中含有双亲的 7 个亚基(
33、1，7+8+19 ，2+5+10)，CS 最小亚基（ 12）被抑制，其他亚基表现为共表达，正、反杂交组合中亚基表达相同。37 38 39 40 41 42 43 441 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1920 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36图 4 部分 F1 杂种及亲本高分子量麦谷蛋白亚基 SDS-PAGE 分析Fig. 4 HMW-GS composition analysis of some F1 crossing hybrids and their parents1,
34、16, 38: CS; 2: J771/CS; 3, 20, 29: J771; 4: J771/XC9; 5: XC9/J771; 6, 19:XC9; 7: XC9/Bobwhite; 8: Bobwhite/XC9; 9, 41: Bobwhite; 10: JD8; 11: NC4/JD8; 12:NC4/XC9; 13, 26, 32, 44: NC4; 14: CS/NC4; 15: NC4/CS; 17: CS/XC9; 18: XC9/CS; 21: J771/CB037; 22: CB037/J771; 23: CB037; 24: NC4/CB037; 25: CB037/
35、NC4; 27: NC/WM151A; 28: WM151A; 30: J771/NC4; 31: NC4/J771; 33: NC4/YM12; 34: YM12/NC4; 35: YM12; 36: Verry; 37: S4185; 39: CS/Bobwhite; 40: Bobwhite /CS; 42: Bobwhite /NC4; 43: NC4/BobwhiteCS/Bobwhite 正交组合中表达了双亲的 6 个亚基(7+8，2+12+5+10) ，亚基 2*被抑制，Bobwhite/CS 反交组合中表达了双亲的 6 个亚基(2*，7+8 ，12+5+10)，2 亚基被抑制。
36、Bobwhite/宁春4 号正交组合中表达了双亲的 7 个亚基(1+2*，7+17+18， 5+10)，而宁春 4 号/Bobwhite 反交组合中表达了双亲的 5 个亚基(1+2*，7，5+10)，来源于宁春 4 号的亚基（ 17+18）被抑制。京 771/CB037 正交组合中含有双亲的 5 个亚基(1 ，17+18 ，5+10)，来源于 CB037 的（2+12）亚基被抑制，其他亚基表现为共表达，CB037/ 京 771 反交组合中含有双亲的 6 个亚基 (1，17+18，2+5+10) ，来源于 CB037 的2 亚基被抑制，其他亚基表现为共表达，说明京 771 细胞质对 12 亚基的
37、表达有影响。宁春 4 号/CB037 正交组合中含有双亲的 6 个亚基(1 ，17+18 ，2+5+10) ，来源于 CB037 的 12 亚基被抑制，CB037/ 宁春 4 号反交组合中含有双亲的 6 个亚基 (1，17+18，2+5+10) ，来源于 CB037 的12 亚基同样被抑制，但出现了 1 个与 7 亚基大小相似的新带，其他亚基表现为共表达。京 771 和宁春 4 号高分子量麦谷蛋白亚基组成完全相同，京 771/宁春 4 号正交组合中表达了双亲的 5 个亚基(1，17+18 ，5+10)，而宁春 4 号/ 京 771 反交组合中除了表达双亲的 5 个亚基(1，17+18，5+10
38、)外，出现了 2 个新带，一条带的大小与 7 亚基类似，另一条带的大小与 8 亚基类似。宁春 4 号/扬麦 12 正交组合中表达了双亲的 7 个亚基(1 ，8 +18，2+12+5+10)，亚基（7+17）被抑制，扬麦 12 /宁春 4 号反交组合中表达了双亲的 8 个亚基(1，7+8+17+18，2+5+12)，10 亚基被抑制。2.5 典型杂交组合后代中 HMW-GS 新亚基跟踪选择和纯合利用 SDS-PAGE 从宁春 4 号/CB037 组合、京 771/宁春 4 号组合的 F2 代子粒中选择含有 HMW-GS 新亚基的单株进行自交，F 3 代继续选择含有新亚基的单株自交，发现目标选择亚
39、基在 F4 代子粒中已基本纯合（图 5） 。宁春 4 号/CB037 组合的纯合株系中含有与 7 亚基大小相似的新带，京 771/宁春4 号组合的纯合株系中含有与 7 亚基大小相似新带的同时，17 亚基被抑制。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10图 5 宁春 4 号/CB037 组合、京 771/宁春 4 号组合的纯合株系 HMW-GS 组成鉴定Fig. 5 Identification of HMW-GS constitution in the stable lines from the crosses of Ningchun4/CB037 and Jing771/Ningchun41：
40、CB037 ；2：宁春 4 号；3-5：宁春 4 号/CB037 组合 F4 代纯合株系；6：宁春 4 号；7：京 771；8-10：京 771/宁春 4 号组合 F4 代纯合株系3 讨论3.1 组织培养与性状变异研究表明，在组织培养过程中多倍体物种比低倍性物种具有更高的变异性 24。黑麦草的组织培养过程中已发现许多表型及染色体结构变化 25。而引起组织培养过程中这些变化的主要原因有点突变、染色体重排及重组、DNA 甲基化、基因拷贝数的变化及转座子元件的插入等 24。Phillips 等 26认为由于组织培养过程能够打破正常的细胞分裂，从而导致染色体断裂进而引起一系列染色体结构异常，如缺失、重
41、复、倒位及易位 27。此外，组织培养过程能够活化一些转座子，如水稻转座子 Tos17，随着组织培养时间的延长，转座子的拷贝数也增加至 530 个，进而诱发染色体结构变异 28。Banks 等29利用中间偃麦草与小麦杂交，并结合组织培养将中间偃麦草抗黄矮病基因转入小麦，在 1200 个后代群体中发现 8 株稳定抗病。离体花药由于染色体和基因组的单倍行，培养过程中可能更容易发生染色体断裂和重融，导致DNA 序列的重组或丢失 30。本研究在 Alondra、Orofen 、 Verry、新春 9 号和百农 3217 的 134 个花药培养加倍单倍体群体中，30 个加倍单倍体的高分子量麦谷蛋白亚基组成
42、发生了变异，变异率为22.4%。 Alondra 和百农 3217 加倍单倍体高分子量麦谷蛋白亚基发生了频繁变异，Alondra 加倍单倍体中 HMW-GS 变异率达 61.8%，Verry 加倍单倍体次之， Orofen 和新春 9 号加倍单倍体中没有发现变异。小麦花药无性系中高分子量麦谷蛋白亚基发生变异可能起因于有丝分裂异常，产生了染色体结构变异或 HMW-GS 编码基因 DNA 序列的丢失。认为花药培养非常容易诱发 HMW-GS 组成变异，可以用来改良优良小麦品质。3.2 HMW 亚基组成和表达在杂交组合中的变异以前的研究认为，HMW-GS 在 F1杂种中呈共显性表达，细胞质对 HMW-
43、GS 表达几乎不影响 14-16。本研究结果表明，HMW-GS 的确在大多数 F1杂种中共表达。但在宁春 4 号/ 扬麦 12 正交 F1 中表达了双亲中的 7 个亚基， （7+17）亚基没有表达，在扬麦 12/宁春 4 号反交 F1 中表达了双亲中的 8 个亚基，10 亚基被抑制；在京 771/CB037 正交 F1 中表达了双亲中的 5 个亚基，来源于 CB037 的（2+12）亚基被抑制，在 CB037/京 771 反交 F1 中表达了双亲 CB037 和京 771 中的 6 个亚基，来源于 CB037 的 2 亚基被抑制，表明高分子量麦谷蛋白亚基并非在所有 F1 组合中呈共显性，细胞质
44、可能对 HMW-GS 表达有影响。在 CB037/宁春 4 号和宁春 4 号/ 京 771 组合中分别出现了 1 个双亲所没有的新亚基。这种杂交后代中 HMW-GS 表达被抑制和出现新亚基现象，可能是减数分裂过程中现了HMW-GS 编码基因部分 DNA 序列的丢失和基因内部重组，也可能是基因结构的变异。HMW-GS 编码基因是一个多基因家族，存在较多等位基因和复等位基因，相互间序列保守，含有较多 DNA 重复序列，在结构上非常容易发生变异，如黑麦基因组异染色质区域的重复序列增强黑麦组织培养过程中染色体的不稳定性 31。此外，在编码区氨基酸的突变和缺失会导致新的 HMW-GS存在 32。Zhan
45、g 等 33报道在利用从小麦中克隆的 HMW-GS 基因构建表达载体的过程中，HMW-GS基因也会发生序列丢失现象。Yan 等 34借助普通 SDS-PAGE、A-PAGE 及 CE 相结合技术对 198 个粗山羊草（Aegilops tauschii）品种 HMW-GS 研究表明许多等位变异的存在，其中包括一些新的 x-及 y-型亚基以及许多新的亚基组合。而这些新出现的高分子量亚基被认为可能是由普通六倍体小麦内几种HMW-GS 编码基因之间稀有的不均等交换产生 35。本研究发现，在小麦品种间杂交后代中 HMW-GS的遗传和表达并不一定呈完全共显性，在一些组合中个别亚基的表达被抑制，甚至出现双
46、亲所没有的新亚基。HMW-GS 表达在一些正、反交组合中结果不完全一致，也存在细胞质效应。品种间杂交后代中应加强对 HMW-GS 组成的鉴定和选择，定向培育优质小麦新品种。小麦花药培养和杂交重组诱发了 HMW-GS 组成变异，其原因有待探讨，新亚基有待进一步鉴定。花药培养和品种间杂交诱发 HMW-GS 组成变异现象可以用来获得新亚基编码基因，在改良小麦HMW-GS 亚基组成方面具有一定潜力。参考文献1 Kolster P, Krechting C F, van Gelder W M. Quantification of individual high molecular weight subu
47、nits of wheat glutenin SDS-PAGE and scanning densitometry J. Journal of Cereal Sciences, 1991, 15: 49612 Shewry P R, Haltord N J, Tatham A S. High molecular weight subunits of wheat glutenin J. Journal of Cereal Sciences, 1992, 15: 1051203 李保云 , 王岳光 , 刘凤鸣, 等. 小麦高分子量谷蛋白亚基与小麦品质性状关系的研究 J. 作物学报, 2000, 2
48、6: 3223264 Payne P I, Law C N, Mudd E E. Control by homoeologous group 1 chromosomes of the high molecular weight subunits of glutenin, a major protein of wheat endosperm J. Theoretical and Applied Genetics, 1980, 58: 1131205 Payne P I, Lawrence G J. Catalogue of alleles for the complex gene loci, Glu-A1, Glu-Bl and Glu-Dl which code for high molecular weight subunits of glutenin in hexaploid wheat J. Cereal Research Communications, 1983, 11: 29356 Payne P I. Genetics of wheat storage protein and the effect
