1、1基因工程原理复习题思考题考试时间：2009.06.21 上午 9：00-11：00 地点 5D305基因工程绪论1、基因工程的定义与特征。定义：在体外把核酸分子（DNA 的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组 DNA） ，引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系） ，生产人类急需的药品、食品、工业品等。特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。2、 强调了确定的 DNA 片段在新寄主细胞中的扩增。2、试述基因工程的主要研究内容。1） 、目的基因的分离2） 、DNA 的体外重组（载体、受体系统等）3） 、重组 DNA 分子转移到受体细胞及其
2、筛选4） 、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。3、基因工程在食品工业上有何应用发展？主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种；第二，延长食品保存时间或增加营养成分；第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力， 减少了农药的使用量，有利于环境保护；第四，转基因技术及基因食物在医
3、学方面得到广泛研究和应用。人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物， 产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。转基因作物的大面积种植已有数年， 食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可， 食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。第一章 DNA 的分子特性与利用1、 原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？1）原
4、核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。2）真核生物基因表达的特点： 1基因组 DNA 存在的形式与原核生物不同； 2真核生物中转录和翻译分开进行； 3基因表达具有细胞特异性或组织特异性； 4真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA 水平的调控、转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控； 22、 什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能单位。根据基因的产物，基因可分为三类： 转录并翻译编码蛋白质的基因:包括结
5、构蛋白基因、编码酶的基因、调节基因 转录但不翻译产物的基因:包括 tRNA、rRNA 不转录但有功能的 DNA 区段:如启动子、操纵基因3、 引起核酸变性的因素主要有哪些？核酸变性后性质有何变化？引起核酸变性的因素：-温度、酸、碱、甲醛和尿素等。DNA 变性后，它的一系列性质发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高（增色效应）, 粘度降低等，如 DNA 增加 2540%. RNA 约增加 1.1%。 。4、 DNA 复性及其影响因素。变性 DNA 在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA 复性的程度、速率与复性过程的条件有关，也与它本身的组成和结
6、构有关：分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。（附加：注意：将热变性的 DNA 骤然冷却至低温时，DNA 不可能复性。但是将变性的DNA 缓慢冷却时，可以复性。复性的应用：核酸的杂交，分子扩增）第二章 基因工程操作的基本技术1. DNA 凝胶电泳中核酸分子分离的机理。在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。2. DNA 凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影响 分子的大小：小则快 带电荷数：多则快 分子构型：超螺旋解螺旋2）电场：直流电场 电压高则快
7、电压太高则结果不准确常用 35V/CM3）支持物介质 种类：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶浓度: 浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；浓度小，筛孔大，适合大分子电泳4）电泳缓冲液 pH 值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大发热快胶溶解 种类：TAE、TBE 、TPE 、TNE33. PCR 的原理和主要反应过程，并分析影响 PCR 扩增的影响因素。PCR 原理：变性温度下， DNA 双链变性双螺旋解开成单链 DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链 DNA 特异结合，然后在 DNA 聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导
8、下合成与模板 DNA互补的新链，实现 DNA 的扩增。影响 PCR 扩增的影响因素：(1)Taq 酶：常用 1U/25L浓度低，扩增产物不够；浓度高，非特异性扩增增加；酶的活性；(2)dNTP 的浓度：常用 100-200mol/L，不能低于 20mol/L，特异性、保真性；(3)模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个 ng 到 100ng.(4)引物浓度：0.1-0.5mol/L 之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体；(5)Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L；影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性(6)PCR 反应程序设定：
9、变性温度和时间、引物退火温度 Tm 与时间、引物延伸温度与时间和循环数4. PCR 引物设计的原则，若给一指定 DNA 序列并需要通过 PCR 扩增此序列，如何设计扩增引物？（关于如何设计这个问题，靠自己了）引物设计原则：1、G+C 含量 45-55%；2、Tm 值高于 55；3、引物特异性；4、引物扩增跨度；5、是否形成引物二聚体5. 定量 PCR 的原理？Ct 值的含义。原理：通过实时检测 PCR 每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量及定性的分析。初始模板量 X0 的对数值与 C(T) 值之间呈线性关系：log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N
10、Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号开始由本底进入指数增长阶段时到达设定的域值时所经历的循环数（如后图所示，图仅供参考）Threshold line C(t) value C(t) value18.12 +/- 0.04阈值线 Ct值Ct值46. 分子杂交的类型主要有哪些？探针的标记方法与标记类型？常用的双链 DNA 的标记方法是哪两种？探针的标记方法：切口平移法、随机引物合成法，末端标记法，PCR 标记法，体外转录标记法。探针按核酸分子分：DNA 探针和 RNA 探针；按标记物的不同：放射性标记探针和非放射性标记探针。标记类型：按核酸分子的不同：可分为 DNA 探针和 RNA 探针根据标
11、记物的不同：可分放射性标记探针和非放射性标记探针；双链 DNA 探针标记主要方法：切口平移法、随机引物合成法；7. Southern 杂交一般过程及影响杂交因素。Southern 杂交操作步骤:(1) 用限制性内切酶酶切 DNA, 经凝胶电泳分离各酶切片段； (2) 转膜：将 DNA 片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；(3) 预杂交：封阻滤膜上非特异性位点； (4) 杂交：让探针与同源 DNA 片段特异性结合；(5) 洗脱：去除非特异性结合的探针；(6) 自显影检查目的 DNA 所在的位置。Southern 杂交影响因子1） 、目的 DNA 在总 DNA 中所占的比例2） 、探针的大小和标记
12、效率3） 、转移到滤膜上的 DNA 量4） 、探针与靶 DNA 的同源性8. 基因组文库的构建过程？如何确定文库的大小？基因组文库的构建过程：1）从生物体提取大片断的基因组 DNA；2）用适当的限制性内切酶（常为 4 碱基识别位点）进行部分酶切或超声波打断基因组DNA ；3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的 DNA 片断（根据载体的要求） ； 4）载体的酶切、回收；5）将处理好的基因组 DNA 片断与载体连接；6）将重组子导入宿主细胞57）文库的鉴定、收集、保存；确定文库大小的方法：以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质量或完备性，它与基因文库最低所含克隆数 N（即
13、文库大小）之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中：N：文库所需的总克隆数；P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率；f：克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小。9. 基因文库的类型包括哪两种？各有什么特点？10. 一般质粒 DNA 的构型有哪几种？在琼脂糖凝胶电泳中的有何特点？超螺旋质粒 DNA、开环质粒 DNA、线状质粒 DNA在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：超螺旋质粒 DNA线状质粒 DNA开环质粒 DNA11. 碱裂解法提取质粒 DNA 的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。碱裂解法原理：在碱性条件下，双连 DN
14、A 氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌 DNA 不能复性呈不溶物而经离心除去。（各种可能因素是上一届的，具体其实大家可以根据那天师兄说的去写）提取失败：1）洗去双链时，将质粒 DNA 洗去；2）破壁失败，质粒没析出；3）加剂问题电泳失败：1）电压太高 2）没加染色剂3）胶穿孔 4）电泳时间过长12. 电泳缓冲液使用一定时间后出现 DNA 在凝胶中跑不动现象的原因，有何解决办法？原因：电泳缓冲液的离子的富集作用；解决方法：1.更换成新配置的电泳缓冲液；2.把电泳槽中的缓冲液倒出混匀后再重新使用13. 电泳的指示剂和染色剂有何区别，
15、各自的作用是什么？指示剂一定要在电泳前加入，指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400 组成载样缓冲液；（一般为：溴酚兰，二甲苯青）作用：预知电泳的速率及方向；使样品呈现颜色，便于加样；一些高浓度蔗糖或其它物质增加 DNA 的密度，可以防止 DNA 的扩散染色剂即可以在电泳前加入样液，又可以电泳后再对凝胶染色；（溴化已锭EB、硝酸银、Goldview 染料）作用：呈现出核酸电泳后的带型。6第三章 基因克隆的酶学基础1、 限制性核酸内切酶的类型，基因工程常用的是哪种限制性核酸内切酶？（常用 II 型）2、 什么是星活性，产生星活性的因素可能有哪些？在非最适合的条件下酶的识别特异性降低，产生非特异性带
16、，这种活性称星活性。产生 Star 活性的因素：（书上 P46-P47 答案）高浓度甘油，碱性 pH，存在 Mn2+，低离子强度，低盐浓度，低 pH3、 结合已做的实验，分析影响酶切的因素。 （这个答案是上届的，仅供参考）1）DNA 的纯度：DNA 中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA 等都会影响酶的活性。 2）DNA 的甲基化程度 ：dam 甲基化酶（修饰 GATC 中的 A） ； dcm 甲基化酶（修饰CCA/TGG 的 C） 。3）温度 ：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是 37 oC，少数要求 40-65 oC。4）缓冲液(Buffer) ：是影响限制酶活性的
17、重要因素。 MgCl2、NaCl/KCl： 提供 Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持 pH； 二硫苏糖醇（DTT）： 保持酶稳定性； 牛血清白蛋白 BSA 等： 有助于酶的稳定；巯基乙醇： 保持酶的稳定性，防止酶失活4、 限制性核酸内切酶命名规则及各字母代表的含义。 （例子和图帮助大家理解而已）命名规则：寄主菌属名的第 1 个字母种名的前两个字母菌株或菌型代号（大写）空白发现序列（罗马数字）例子：EcoR(E：属名；co ：种名； R：株；：发现次序 )75、 简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。同裂
18、酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。 ）6、 连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA 连接酶和 RNA 连接酶异同点：相同点：都能以 DNA 为模板，从 5向 3进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。不同点：DNA 聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在 DNA 复制中起作用；而 RNA 聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 影响因素：（影响因素就四个，后面分析觉得烦的话大家自己看着办啦）1）连接所用的目的片段的状态： 效率：粘性末端平端
19、(100 倍)； 5，突出3，突出；平端：HaeIIIAluIHinCIISmaI2）连接温度连接效果最好在 37 ，但形成的互补不稳定;最佳连接温度：12-16 ，较好的连接效果，互补又较稳定;3）反应液中的成分： ATP：反复冻熔，ATP 活性降低，ATP 溶解度不高，连接缓冲液宜分装；单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率4）插入片段与载体的浓度比例 载体 DNA 与外源 DNA 的分子摩尔比通常为 13 左右，甚至 110 或更高。目的或作用：增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。7、 试分析提高平端 DNA 连接效率的
20、可能方法。 （传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。3、足够多的载体和插入片段是最重要的 。4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比 14 度好88、 基因工程中常用的 DNA 聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌 DNA 聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA 聚合酶 4）T4 DNA 聚合酶 5）修饰过的 T7 DNA 聚合酶 6）逆转录酶7）Taq DNA 聚合酶第四章 基因
21、克隆的载体系统1、 作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） ； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源 DNA 的载装能力； 具有多克隆位点（MCS） ； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。2、 质粒的不相容性及其分子机理。 定义：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。 分子机理：两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制同时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。3、 载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载
22、体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、 质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？A、 化学法（CaCl2 法)转化原理：是 Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或 DNA 重组分子便可进入细胞内（感受态细胞） 。B、 电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或 DNA 重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和
23、细胞膜产生缝隙，质粒或 DNA 重组分子便可进入细胞内。影响转化率的主要影响因素:1）载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；2）插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；3）受体细胞的类型及预处理；4）转化方法：电击法高于化学法。5、重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。从总体上看，重组体分子的选择与鉴定方法基本上可以分为如下几个类型： （1）基于载体遗传标记检测法在构建基因工程载体系统时，载体 DNA 分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。（2）基于克隆 DNA 序列
24、检测法9Southern 印迹杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链 DNA 探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA 片段。（3）基于外源基因产物检测法如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。6、用已学过的重组体分子的选择与鉴定技术，试设计一个试验方案，假如一特异 PCR 扩出的基因或基因片断重组进 T 载体并转化大肠杆菌，如何鉴定并获得真实转化子？(自理)第五章 基因的克隆一般方法1、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原
25、理（至少 3 种，都是书上找的，自选哈，建议必选 DD RT-PCR 和 SSH，原因请看下题）？1）差减杂交（SH）通过 DNA 复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。2）抑制性差减杂交（SSH）SSH 的核心技术是抑制性 PCR，它是一种将检测子 cDNA 单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的 cDNA 单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。3）差异显示 PCR（DD RT-PCR）利用真核生物 mRNA 结尾处有 POLY（A ）结构，在其 3
26、端设计象 5-T11GA 样引物，该引物可与 mRNA 总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合 5端的随机引物（20 条 10-mer） ，可以使不同长度的基因得到扩增。4）DNA 代表性差异分析（DNA RDA ）代表性差别分析是通过突变型（驱赶 DNA，driver DNA）与野生型（检测 DNA，tester DNA）基因组之间的差异来分离和鉴定突变基因的方法。5）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）基因组 DNA 经过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为 DNA 模板。接头和与接头相邻的
27、酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。参考文献：关德军.AFLP 技术原理及其在植物研究中的应用.安徽农业科学，2006，34（15）：3625-3628 ）6）cDNA 微阵列建立一套统一且具有高质量、高代表性的 cDNA 列阵膜，在这一列阵膜上每个 cDNA 克隆都有固定的位置和编号，这样大大方便了数据的综合比较分析，并可对每个 cDNA 克隆子进行定量分析。在列阵杂交的基础上，还可以进行杂交测序，从而测定每个 cDNA 克隆子的序列。2、简单阐述差异显示 PCR 克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？主要原理：利用真核生物 mRNA 结尾处有 POLY（A ）结构，在其 3端设计象 5
28、-T11GA样引物，该引物可与 mRNA 总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合 5端的随机引物（20 条 10-mer） ，可以使不同长度的基因得到扩增。优点： 简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA 的组成。 所需的 mRNA 量少。 各样本 mRNA 的差异可同时进行比较。10 扩出的 cDNA 可直接用于测序、文库筛选等。缺点： 假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。 工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是 3端比较短的 UTR 区的一段序列，提供的信息较少。利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程研究领域发
29、挥了极大的作用。 （P221）3、抑制性差减杂交的原理与应用。原理：SSH 的核心技术是抑制性 PCR，它是一种将检测子 cDNA 单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的 cDNA 单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。应用： 基因突变体的研究：如基因的表达与不表达； 基因时空表达的研究：如根、茎、叶； 不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。4、酵母双杂交技术、噬菌体表面展示技术的原理。A酵母双杂交技术原理：大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，
30、一个是 DNA 特异结合域（DNA-binging domain,BD） ，一个是转录激活域(transcriptional activation domain,AD)。这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成其激活功能。不同来源的激活因子的 BD 区与 AD 区结合后则能特异地激活 BD 结合基因的表达。B噬菌体表面展示技术原理：当外源 DNA 片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中时，如果两者读码框结构保持一致，这个外源 DNA 片段所编码的产物可与此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。利用
31、抗此外源基因编码产物（多肽或蛋白）的抗体，通过亲和纯化，就能从大量的噬菌体中富集、分离出含有所要的基因的融合噬菌体。然后，通过基因扩增，得到大量所要的目的基因。5、T-DNA 标签法克隆基因的一般技术路线。 农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。 建立突变体基因组文库及野生型基因组文库. 用 T-DNA 片段做 probe 筛选突变体文库，获得阳性克隆。 用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。 把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。第七章 克隆基因的表达1、通过比较，分析大肠杆菌表达系统和酵母表达系统各有何优缺点。大肠杆菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，共有 4405 个开放型阅读框架； 基因克隆表达系统成熟、完善； 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定； 被 FDA 批准为安全的基因工程受体生物。大肠杆菌表达外源基因的劣势： 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能； 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；
