1、1考力代绵羊选育与种质资源开发利用项目技术报告一、研究的目的意义考力代绵羊是贵州半细毛羊培育的主要父本，已适应在山区高寒、高湿条件下生长，成为毕节市本土化绵羊品种，深受老百姓喜爱。由于农户饲养方式较传统，品种选育意识不高，以致该品种出现退化现象，生产性能在下降，存在养殖比较效益不高的问题，所以，开展考力代绵羊的提纯复壮，对推进毕节市养羊业的发展具有重要意义。二、主要研究内容1、开展提纯复壮研究。采取传统选育及分子标记辅助选育相结合的方法，使考力代羊生产速度、繁殖性能有所提高。2、开展营养调控研究。组建试验羊群，设计营养配方，进行饲料配方筛选。3、开展杂交试验研究。导入生长速度快、繁殖性能高的外
2、血品种杂交，观察后代生产性能，为新品系培育奠定基础，为考力代羊开发探索新路子。三、项目研究内容完成情况（一）考力代绵羊提纯复壮研究1、核心群的组建项目经过初步选择标准选择后，建立了核心群。核心群成员除了以上的种羊外，以后不断地从其后代羊群中挑选成绩优秀的个体，对2核心群进行补充和扩大，不断提高核心群的总体水平，核心群组建后，由于有后代的参与，要做好每只羊的档案记录和配种安排，避免近交衰退。通过选种选配和后裔选择，在贵州新乌蒙生态牧业发展有限公司种羊场建立了核心群（表 1） 。表 1 考力代绵羊种羊选择标准 单位：kg、cm类别 体重 毛量 毛长 备注成年公羊 55 4.5 11.0成年母羊 3
3、5 3.0 9.0一岁公羊 40 3.5 11.0一岁母羊 28 2.5 9.0群体要求羊毛主体细度50-58支，净毛率50%，产羔率 100%。2、生产性能（1）体重水平项目实施后，核心群周岁公、母羊体重 55.76kg、45.69kg，比选育前提高 15.66%、15.76% ；核心群成年公、母羊体重 65.86kg、49.72kg，比选育前提高 24.24%、17.26%。 （表 2） 。表 2 实施前后核心群体重统计 单位：kg、只周岁 成年种羊类别 性别实施前 实施后 实施前 实施后公羊 48.210.68 55.764.35 53.011.22 65.865.15核心群母羊 39.
4、471.25 45.693.84 42.41.05 49.724.72（2）产毛量、羊毛长度及细度根据测定，成年公、母羊产毛量分别为 5.88kg、4.86kg，提高5.76%、17.96%，羊毛长度分别为 12.785.23cm、11.234.95cm，羊毛细度分别为 28.445.1um、27.865.72um（表 3） 。表 3 产毛量、羊毛长度及细度测定统计 单位：kg、cm、um成年公羊 成年母羊（kg）类别实施前 实施后 实施前 实施后3产毛量（kg） 5.56 5.880.88 4.12 4.861.52羊毛长度（cm） 9-13 12.785.23 9-13 11.234.95
5、cm羊毛细度（um） 28.445.1 27.865.72（3）屠宰率测定屠宰周岁羯羊 3 只，周岁羊屠宰率为 51.01%，净肉率 34.54%（表4） 。表 4 考力代绵羊屠宰测定屠宰率 净肉率年龄 编号宰前活重（kg）胴体重（kg） 净肉重（kg）（%） （%）1 55.5 28.2 19.2 50.81 34.59 2 56.4 28.9 19.8 51.24 35.11 周岁羯羊 3 55.7 28.4 18.9 50.99 33.93 平均 55.87 28.50 19.30 51.01 34.54 （4）产羔率项目点产羔统计，平均产羔率为 112.32，繁殖成活率达 91.6%。
6、可见考力代绵羊产羔率低，还需加强双羔母羊的选择（表 5） 。表 5 考力代绵羊繁殖性能统计年度 母羊胎次（胎） 产羔数（只） 成活羔数（只） 成活率（ %） 产羔率（%）2016.12017.1 326 364 332 91.2 111.662017.12017.12 583 657 604 91.9 112.69平均 455 511 468 91.6 112.32（二）生长速度、繁殖性能和毛用性状相关基因分子标记研究对影响毛羊的生长性状的基因 GHSR、CIS、繁殖力性状的基因GDF9、BMP15 、ESR、毛用性性状的 KRT26 为侯选基因进行筛选，采用 PCR 产物直接测序法对上述基因
7、进行单核苷酸多态性检测，以期寻找到与高繁殖力，高生长，毛用性能好相关的 SNPS，确定基因效应，探求与三个性状相关的遗传标记，为考力代绵羊的进一步选育提供理论依据。4（1）实验样品：考力代绵羊选自马干山种羊场，自繁自养，健康状况良好的基础经产母羊共 36 只。（2）实验方法采集样品：每只羊通过颈静脉采集血液，装在真空抗凝采血管中，快速振荡混匀，放入冰盒，带回实验室-20 冰箱保存备用。羊基因组 DNA 的提取：采用 EZUP 柱式血液基因组 DNA 抽提试剂盒提取 DNA，并用紫外分光光度计测量其浓度测 OD 值，计算 OD 260 / OD 280 比值，若比值接近 1.8 ，说明样品中的蛋
8、白质去除的比较干净；若比值小于 1.6 ，说明样品含有较多的蛋白质或其它离子， DNA 抽提效果不好，需重新提取。引物：根据 GenBank 发表的绵羊 GDF9 基因( 登录号：NC_019462)的第二外显子、BMP15 基因( 登录号: NC_019484.1)的第二外显子、ESR 基因( 登录号:NC_019465.1)部分外显子序列，GHSR(登录号: NM_001009760.1)，CISH (登录号:NC_019476.1)、KRT26(登录号: XM_004012872.1)第一、二外显子， 采用 Primer5.0 软件自行设计引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序
9、列见表 6 。表 6 引物序列、产物长度及退火温度使用真空冷冻干燥的 OligoDNA 为白色粉末，附在离心管内壁上。稀释前，将引物管离心数秒使 DNA 聚集到管底，加入 100 倍摩尔数引物 产物长度 上游引物序列( 53) 下游引物序列( 53) GDF9 768bp GCTCCATACTCATTTACCT ATGAAGATATGATAGCCACTBMP15 774bp CTTCACCTAACTCATTCCCAC TACTCCCATACTAACGGGTCAG ESR 712bp ATTCGCTCGCTCGGTTCTAT AGGGGGAGGTGAGGCTTGGTTGHSR 549bp TCA
10、CTCATTATTCTACACCAGAAGC ACACCCAATFTCCAAATTAAGG CISH 765bp CCAGGGAGAGGTGAGGAGAA TTTACTGGGTGCCCTAGCAGKRT26 841bp GGGCCAGCTTTCCACCTAC CCAAGCGCTGGGAATGTAGT 5的双蒸水，盖好管盖，涡旋震荡混匀并使其充分溶解，然后再离心数秒，保存 4冰箱过夜。第二天取出放入-20保存备用。PCR 产物检测：取 PCR 扩增产物 4l,同时用 DL2000DNAMarker作参照，点样于 1%琼脂糖凝胶中电泳，电压 120V，电泳 25min。电泳结束后将琼脂糖凝胶放在凝
11、胶成象系统上观察并记录扩增片段的大小和浓度，选取扩增效果好且量足的样品进行后续实验。测序和 BLAST 分析：将特异性好、产量高的 PCR 产物委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行纯化和双向测序，测序结果利用 DNASTAR 软件对测序结果进行校正，BLAST 分析确定 SNPs。（3）结 论根据绵羊 GDF9 基因序列的第二外显子、BMP15 基因序列的第二外显子、ESR 基因部分外显子、GHSR 基因的第二外显子、CISH 基因的部分外显子、KRT26 基因的第二外显子序列设计引物，采用 PCR 产物直接测序法检验在品种中的基因多态性，并与产仔数，生长性能，毛用性能进行相关分析，结论如下
12、：一是对六个基因进行 PCR 扩增，确立了最佳 PCR 反应条件和反应体系，对 PCR 产物纯化后进行直接测序，测序结果显示考力代绵羊品种的三个性转的六个基因中，影响繁殖性状及生长性状的五个基因均为中度多态，而影响毛用性能的 KRT26 基因比较稳定。二是检测 GDF9 基因在第 2 外显子的 562 bp 处有 1 个 AC 的单碱基突变,碱基突变导致谷氨酰胺突变为脯氨酸。考力代绵羊产羔数在两个基因型之间呈现出 ACAA，差异极显著( PCC，差异显著 (PGG，差异显著 ( PTGGG，差异极显著 (P0.01 ) 。五是在 GHSR 基因中检测出 2 个单碱基突变。T70G 和 G229
13、T 均引起氨基酸同义突变。突变前后 GHSR 基因 RNA 二级结构发生改变，最小自由能由-378.3 KCal/mol 变为-377.6 KCal/mol，并影响到蛋白质二级结构的稳定性。六是在 CISH 基因中检测出第二外显子的 213bp 处有一个 TC 的单碱基突变，为同义突变，没有引起氨基酸的改变。七是影响毛用性能的基因 KRT26 没有突变发生，结构比较稳定，不会引起考力代绵羊毛用性能发生改变。（三）考力代绵羊导入外血提高生产性能的杂交组合试验项目实施中开展两个杂交试验，分别利用陶赛特绵羊和萨福克绵羊与考力代绵羊杂交，陶考杂 F1 代、萨考杂 F1 代 3.5 月龄断奶体重分别为
14、16.342.94kg、18.754.53kg，比考力代 15.194.28kg 分别提高了 7.57%、 23.44%，杂交试验效果显著（表 7） 。表 7 杂交试验统计父本品种 母本品种 初生重（kg）3.5 月断奶重（kg）杂交 F1 比纯繁提高比例考力代 考力代 3.654.43 15.194.28陶赛特 考力代 4.124.67 16.342.94 7.57%萨福克 考力代 4.755.42 18.754.53 23.44%（四）设计配方，筛选饲料配方根据贵州新乌蒙生态牧业发展有限公司饲料原料情况筛选出的相关饲料配方见表 8-16。7表 8 考力代绵羊种公羊非配种期全混日粮配方及营养
15、成分原料 配比/% 营养素 含量/%玉米 42.0 干物质 85.38麦麸 10.0 消化能/（兆焦/千克） 11.50玉米秸秆 35.0 代谢能/（兆焦/千克） 9.43豆饼 10.0 粗蛋白 11.07磷酸氢钙 1.0 粗脂肪 2.73石粉 1.0 中性洗涤纤维 35.74食盐 0.5 酸性洗涤纤维 24.83预混料 0.5 钙 0.62合计 100 磷 0.44表 9 考力代绵羊空怀和妊娠前期母羊混合精料配方原料 配比/% 营养素 含量/%玉米 58.0 干物质 83.43豆粕 5.0 消化能/（兆焦/千克） 13.20麦麸 10.0 代谢能/（兆焦/千克） 10.76米糠 10.0 粗
16、蛋白 15.10菜籽粕 13.0 粗脂肪 4.24磷酸氢钙 0.5 中性洗涤纤维 15.37石粉 2.0 酸性洗涤纤维 7.04食盐 0.5 钙 0.88预混料 1.0 磷 0.65合计 100表 10 考力代绵羊妊娠后期母羊精料配方原料 配比/% 营养素 含量/%玉米 58.0 干物质 84.02豆粕 8.0 消化能/（兆焦/千克） 13.23麦麸 6.5 代谢能/（兆焦/千克） 10.85米糠 8.0 粗蛋白 16.97菜籽粕 16.0 粗脂肪 3.84磷酸氢钙 0.5 中性洗涤纤维 14.73石粉 1.5 酸性洗涤纤维 7.23食盐 0.5 钙 0.72预混料 1.0 磷 0.648合计
17、 100表 11 考力代绵羊泌乳后期混合精料配方及营养成分原料 配比/% 营养素 含量/%玉米 60.0 干物质 87.36大豆粕 8.0 消化能/（兆焦/千克） 13.06麦麸 16.0 代谢能/（兆焦/千克） 10.71菜籽粕 12.0 粗蛋白 15.72磷酸氢钙 1.0 粗脂肪 2.95石粉 1.5 中性洗涤纤维 15.84食盐 0.5 酸性洗涤纤维 6.56预混料 1.0 钙 0.83合计 100 磷 0.67表 12 考力代绵羊羔羊代乳料配方及营养成分原料 配比/% 营养素 含量/%玉米 20.0 干物质 61.24麦麸 10.5 消化能/（兆焦/千克） 9.01大豆 30.0 代谢
18、能/（兆焦/千克） 7.39石粉 1.0 粗蛋白 24.66食盐 0.5 粗脂肪 11.65预混料 1.0 中性洗涤纤维 8.29猪脂 5.0 酸性洗涤纤维 3.96干脱脂奶粉 30.0 钙 0.83酵母 2.0 磷 0.63合计 100表 13 考力代绵羊哺乳期羔羊补料配方及营养成分原料 配比/% 营养素 含量/%玉米 25.5 干物质 84.16豆粕 31.0 消化能/（兆焦/千克） 12.63麦麸 10.0 代谢能/（兆焦/千克） 10.35花生仁粕 15.0 粗蛋白 26.25高粱 10.0 粗脂肪 2.38磷酸氢钙 1.0 中性洗涤纤维 13.92石粉 1.0 酸性洗涤纤维 7.36
19、9食盐 0.5 钙 0.76预混料 1.0 磷 0.66糖蜜 5.0合计 100表 14 考力代绵羊育肥前期精料配方原料 配比/% 营养素 含量/%玉米 59.0 干物质 87.82大豆粕 25.0 消化能/（兆焦/千克） 12.65小麦麸 6.5 代谢能/（兆焦/千克） 10.37磷酸氢钙 0.5 粗蛋白 16.94石粉 0.5 粗脂肪 2.99食盐 1.0 中性洗涤纤维 10.79预混料 4.0 酸性洗涤纤维 4.72米糠 3.5 钙 0.39合计 100 磷 0.47表 15 考力代绵羊育肥中期精料配方原料 配比/% 营养素 含量/%玉米 58 干物质 87.51麦麸 15 消化能/（兆
20、焦/千克） 12.85菜籽粕 18 代谢能/（兆焦/千克） 10.53豆粕 5 粗蛋白 16.79磷酸氢钙 0.5 粗脂肪 2.76石粉 1.5 中性洗涤纤维 13.13食盐 1.0 酸性洗涤纤维 5.79预混料 1.0 钙 0.74合计 100 磷 0.64表 16 考力代绵羊育肥后期精料配方原料 配比/% 营养素 含量/%玉米 70.0 干物质 88.11大豆饼 10.0 消化能/（兆焦/千克） 13.27菜籽饼 14.5 代谢能/（兆焦/千克） 10.88磷酸氢钙 1.0 粗蛋白 13.57石粉 1.0 粗脂肪 4.2910食盐 1.5 中性洗涤纤维 12.14预混料 1.0 酸性洗涤纤
21、维 5.20尿素 1.0 钙 0.73合计 100 磷 0.56四、项目取得成效及创新（一）品种整齐度趋于一致提纯复壮前，羊场同年龄羊只个体大小不一，生产性能参差不齐。提纯复壮后，公羊雄壮，母羊清秀，品种整齐度大大提高。（二）生产性能显著提高与项目实施前相比，项目实施后，核心群周岁公、母羊体重55.76kg、45.69kg，比选育前提高 15.66%、 15.76%；核心群成年公、母羊体重 65.86kg、49.72kg，比选育前提高 24.24%、17.26% ；成年公、母羊产毛量分别为 5.88kg、4.86kg，提高 5.76%、17.96% ，羊毛长度分别为 12.785.23cm、1
22、1.234.95cm，羊毛细度分别为28.445.1um、27.865.72um；周岁羊屠宰率为 51.01%，净肉率34.54%；平均产羔率为 112.32，繁殖成活率达 91.6%。（三）建成的品种群繁殖率异常旺盛项目实施，建考力代保种群 452 只，其中品种整齐度好的核心群118 只、生产群 334 只。据统计：公羊占 12.56%，母羊占 87.44%，公母羊比例基本达到 1：7，周岁以上 5 岁以下种羊占 69.85%，说明羊群处于一种动态的、后备力异常旺盛的状态。（四）筛选饲料配方取得实效针对考力代绵羊生长发育的各个时期，设计饲料配方主要解决饲料结构单一，营养不全，维生素、微量元素缺乏，增重速度慢等问题。通过实地考察和长期的饲喂对比试验筛选出的组方适口性好、营养较全面、增重速度较快。通过饲喂筛选出的相关饲料配方，把好营养调
