1、1第一章 绪论试题精选一、名词解释1、酶 2、酶工程 3、核酸类酶4、蛋白类酶 5、酶的生产 6、酶的改性7、酶的应用 8、酶的专一性 9、酶的转换数二、填空题1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_蛋白类酶_和 核酸类酶_两大类。2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是_核糖核酸，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是_蛋白质_。3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为_自我剪切酶_，_自我剪接酶_。4、酶活力是_酶量_的量度指标，酶的比活力是_酶纯度_的量度指标，酶的转换数的主要组分是_酶催化效率_的度量指标。5、非竞争性抑制的特点是最大反应速度 Vm_减小_，米氏常数 Km_
2、不变_。三、选择题1、酶工程是（C）的技术过程。A、利用酶的催化作用将底物转化为产物 B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶 C、酶的生产与应用 D、酶在工业上大规模应用2、核酸类酶是（D） 。A、催化 RNA 进行水解反应的一类酶 B、催化 RNA 进行剪接反应的一类酶C、由 RNA 组成的一类酶 D、分子中起催化作用的主要组分为 RNA 的一类酶3、RNA 剪切酶是（B） 。A、催化其他 RNA 分子进行反应的酶 B、催化其他 RNA 分子进行剪切反应的 R 酶C、催化本身 RNA 分子进行剪切反应的 R 酶 D、催化本身 RNA 分子进行剪接反应的 R 酶4、酶的改性是指通过各种方法（A）
3、的技术过程。A、改进酶的催化特性 B、改变酶的催化特性 C、提高酶的催化效率 D、提高酶的稳定性5、酶的转换数是指（C） 。A、酶催化底物转化成产物的数量 B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数 D、每摩尔酶催化底物转化为产物的摩尔数四、判断题（V）1、相同的酶在不同的 pH 条件下进行测定时，酶活力不同。（V）2、竞争性抑制的特点是最大反应速度 Vm 不变，米氏常数 Km 增大。（X）3、催化两个化合物缩成一个化合物的酶称为合成酶。（X ）4、RNA 剪切酶是催化 RNA 分子进行剪切反应的核酸类酶。（V）5、水解酶在水溶液中不能催化其逆反应。
4、五、简答题1、何谓酶工程，其主要内容有哪些？答：酶的生产与应用的技术过程称为酶工程。酶的生产是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶，动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。酶的应用是在人工控制条件的反应器中，通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程。主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。在酶的生产与应用过程中，人们发现酶具有稳定较性差、催化效率不够高、游离酶通常只能使用一次等弱点，为此研究、开发了各种酶的改性技术，以促进酶的优质生产和高效应用。酶的改性是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催
5、化、酶定向进化等。酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化、酶定向进化、酶反应器和酶的应用等。2、试述酶活力测定的基本步骤。答：酶活力测定通常包括两个阶段。首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应2液中底物或产物的变化量。一般经过如下几个步骤：（1）根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。所使用的底物必须均匀一致，达到酶催化反应所要求的纯度。在测定酶活力时，所使用的底物溶液一般要求新鲜配制，有些反应所需的底物溶液也可预先配制后置于冰箱保存备用。（2）根据酶的动力学性质，确定酶催化
6、反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。温度可以选择在室温（25） 、体温(37)、酶反应最适温度或其他选用的温度；pH 应是酶催化反应的最适pH；底物浓度应大于 5Km 等。反应条件一旦确定，在整个反应过程中应尽量保持恒定不变。故此，反应应该在恒温槽中进行，pH 的保持恒定是采用一定浓度和一定的 pH 缓冲溶液。有些酶催化反应，要求一定浓度的激活剂等条件，应适量添加。（3）在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。（4）反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。3、简述影响酶催化作用的主要因素。答：酶的
7、催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。（1）底物浓度：在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增加而加快。当底物浓度达到一定的数值时，反应速度的上升不再与底物浓度成正比，而是逐步趋向平衡。（2）酶浓度：在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。（3）温度的影响：每一种酶的催化反应都有其适宜的温度范围和最适温度。在适宜温度范围内，酶才能进行催化反应；在最高温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。（4）pH 的影响：酶的催化作用与反应液的 pH 有很大关系。每一种酶都有各自的适宜 pH 范围和最适pH。只
8、有在适宜 pH 范围内，酶才能显示其催化活性在最适 pH 条件下，酶催化反应速度达到最大。（5）抑制剂的影响：在抑制剂的条件下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能。抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆性抑制剂之分。不可逆性抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难以除去，酶活性难以恢复。可逆性抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。（6）激活剂的影响：在激活剂的影响下，酶的催化活性提高或者由无性得酶原生成有催化活性的酶。4、举例说明酶催化的绝对专一性和相对一性。答：一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。当酶作用的底物含有不对称碳原子时，酶只能作用于异构
9、体的一种。这种绝对专一性称为立体异构专一性。例如，天冬氨酸氨裂合酶【EC4.3.1.1】 ，仅作用于 L-天冬氨酸，经过脱氨基作用生成延胡索酸（反丁烯二酸）及其逆反应都一概不起作用。一种酶能够催化结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。相对专一性可分为键专一性和基团专一性。键专一性的酶能够作用于具有相同化学键的一类底物。如，酯酶可催化所有含酯键的酯类物质水解生成醇和酸。基团专一性的酶则要求底物含有某一相同的基团。如，胰蛋白酶【EC3.4.31.4】选择性地水解含有赖氨酰-或精氨酰-羰基肽键的物质，不管是氨酰、酯或多肽、蛋白质都能被该酶水解。六、综合分析题,试述木瓜蛋白酶
10、的生产方法。答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程酶发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。（1）提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。（2）发酵法：通过 DNA 重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，再通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。（3）植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，再通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶第二章 微生物发酵产酶名词解释1、酶的发酵生产 2、转录 3、翻译 4、酶的诱导5、酶的反馈阻遏 6、分解代谢物阻遏 7、发酵动力学二、填空题1、转录是以 DNA 为模板，以 核苷三磷酸 为底物，在_依赖
11、 DNA 的 RNA 聚合酶 的作用下生成 3RNA 的过程。2、微生物产酶方式可以分为同步合成型， 延续合成型 ,中期合成型， 滞后合成型 四种。3、生长因素是 细胞生长繁殖 所必需的 微量有机化合物 。4、莫诺德常数 Ks 是指生长速率达到 最大比生长速率一半 时的 限制性基质浓度 。5、发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速率， 产物生成速率 ，基质消耗速率及其影响因素的学科。三、选择题1、可以通过添加（ C ）使分解代谢物阻遏作用解除。A、诱导物 B、激活剂 C、cAMP D、ATP2、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以（D ） 。A、诱导酶的生物合成 B、阻遏酶的生物合成 C、提高酶活力
12、 D、提高细胞透过性3、有些酶在细胞进入平衡期以后还可以继续合成较长的一段时间，这是由于（ A） 。A、该酶所对应的 mRNA 稳定性好 B、该酶所对应的 DNA 稳定性好 C、细胞自溶后使酶分泌出来 D、培养基中还有充足的营养成分4、莫诺德常数是指（B ）A、反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。B、比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。C、产酶速率达到最大产酶速率一半时的限制性基质浓度。D、细胞生长速率达到最大细胞生长速率一半时的限制性基质浓度。四、判断题（ X）1、固定化细胞在一定的空间范围内生长繁殖，由于细胞密度增大，使生化反应加速，所以能够提高酶活力。（ V）2、某
13、些酶的催化反应产物可以诱导该酶的生物合成。（ V）3、在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的酶合成方式是延续合成型。（X）4、氨酰-tRNA 合成酶具有识别 mRNA 和 tRNA 的功能。（ X）5、固定化原生质体与固定化细胞一样可以进行生长繁殖和新陈代谢。五、简答题1、为什么属于滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？答：属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期后才开始合成，主要有两个原因：一是由于酶的生物合成受到培养基中阻遏作用，只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而解除阻遏以后，酶才开始大量合成；二是由于该类型酶对所对应
14、的 mRNA 稳定性好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。简述微生物发酵产酶培养基的主要组分及其作用。答：培养基的主要组成包括：碳源、氮源、无机盐和生长因子等。碳源是指能够为细胞提供碳素化合物的营养物质。在一般情况下，碳源也是为细胞提供能量的能源。碳是构成细胞的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。所以碳源是酶的生物合成法生产中必不可少的营养物质。氮源是指能向细胞提供氮元素的营养物质。氮元素是各种细胞中蛋白质。核酸等组分的重要组成元素之一，也是各种酶分子的组成元素。氮源是细胞生长、繁殖和酶的生产的必不可少的营养物质。无机盐的主要作用是提供细胞生命活动所必不
15、可缺的各种无机元素，并对细胞内外的 PH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。生长素是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。氨基酸是蛋白质的组分；嘌呤和嘧啶是核酸和某些辅助酶或辅基的组分；维生素主要是起辅酶作用。简述微生物发酵产酶过程中工艺条件的限制性。答：微生物发酵产酶的过程中，必须根据需要和变化情况，适时进行 PH、温度、溶解氧等发酵工艺条件的控制。（1）PH 的调节控制：培养基的 PH 与细胞的生长繁殖以及发酵产酶关系密切，不同的细胞，其生长繁殖的最适 PH 有所不同，细胞发酵产酶的最适 PH 与生长最适 PH 也往往有所不同，所以必须根据不同的细胞
16、特性和发酵的不同阶段进行 PH 的控制。有些细胞可以同时生产若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的 PH，往往可以改变各种酶之间4的产量比例。随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的 PH 往往会发生变化。所以在发酵过程中，必须根据变化的情况对培养基的 PH 进行适当的控制和调节。调节 PH 的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；也可以使用缓冲液来稳定 PH；或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的 PH，以满足细胞生长和产酶的要求。（2）温度的调节控制：细胞的生长繁殖和发酵产酶需要一定的温度条件，不同的细胞有各自不同的最适生长温度。有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞
17、生长的最适温度有所不同，而且往往低于最适生长温度。要在不同的发酵阶段控制不同的温度。即在细胞生长阶段控制在细胞生长的最适温度范围，而在产酶阶段，控制在产酶最适温度。在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈代谢作用，会不断放出热量，使培养基的温度升高，同时，由于热量的不断扩散，会使培养基的温度不断降低。两者综合结果，决定了培养基的温度。由于在细胞生长和产酶的不同阶段，细胞新陈代谢放出的热量有较大的差别，散失的热量又受到环境温度等因素的影响，使培养基的温度发生明显的变化。为此必须经常及时地对温度进行调节控制，使培养基的温度维持在适宜的范围内。温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地
18、进行温度的调节控制，在发酵罐或者其他的生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水以满足温度调控的需要。（3）溶解氧的调节控制：细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量，为零获得足够多的能量，细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质经过有氧降解而生成大量的 ATP。在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧，由于氧是难溶于是的气体，在通常情况下，培养基中的溶解的氧并不多，在细胞培养过程中，培养基中原有的溶解氧很快就会被细胞利用完，为了满足细胞的生长繁殖和发酵产酶的需要，在发酵过程中必须不断供给氧，使培养基中的溶解氧保持
19、在一定的水平。溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中的溶解氧的量保持恒定。溶解氧的供给，一般是将无菌空气通入发酵容器，再在一定的条件下，使空气中的氧溶解到培养液中，以供细胞生命活动之需。培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速率，溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间，气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般来说，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长。气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。随着发酵过程的进行，细胞耗氧速率发生改变时，必须相应地对溶氧速率进行调节。调节溶
20、解氧的方法主要有调节通气量，调节氧的分压，调节气液接触时间，调节接触面积，改变培养液的性质等，可以根据不同菌种，不同产物、不同的生物反应器、不同的工艺条件下的不同情况选择使用。以便根据发酵过程耗氧速率的变化而及时有效地调节溶氧速率。4、固定化细胞发酵产酶有哪些特点？答：固定化细胞发酵产酶与游离细胞发酵产酶相比，具有下列显著特点：1）提高酶产率：细胞经过固定化后，在一定的空间范围内生长繁殖，细胞密度增大，因而使细胞反应加速，从而提高酶产率。例如，固定化枯草杆菌生产淀粉酶，在分批发酵时，其体积产酶率达到游离细胞的 122%，在连续发酵时，产酶率更高。再如，转基因大肠杆菌细胞生产酰胺酶，经过固定化后
21、的细胞比没有选择压力时游离细胞的产酶率提高 1020 倍。2）可以反复使用或连续使用较长时间：固定化细胞固定在载体上，不容易脱落流失，所以固定化细胞可以进行半连续发酵，反复使用多次；也可以在高稀释的条件下连续发酵较长时间。例如,固定化细胞进行酒精、乳酸等厌氧发酵，可以连续使用半年或者更长的时间；固定化细胞发酵产生淀粉酶等，也可以连续地使用 30d 以上。3）基因工程菌的质粒稳定，不易丢失：基因工程菌经过固定化后，由于有载体的保护作用，质粒的结构稳定性和分裂稳定性都显著提高。4）发酵稳定性好：细胞经过固定化后，由于受到载体的保护作用，使细胞对温度、PH 的适应范围增宽；对蛋白酶和酶抑制剂等的耐受
22、能力增强，所以能够比较稳定地进行发酵生产。这一特点使固定化细胞发酵的操作控制变得相对容易，并有利于发酵生产的自动化。55）缩短发酵周期，提高设备利用率：固定化细胞，如果经过预培养，转入发酵培养基以后，很快就可以发酵产酶，而且能够较长时间维持产酶特性，所以可以缩短发酵周期，提高设备利用率。若不经预培养，第一批发酵时，周期与游离细胞基本相同，但是第二批以后，其发酵周期将明显缩短。例如，固定化黑曲霉细胞半连续发酵生产糖化酶，第一批发酵时，周期为 120h，与游离细胞发酵周期相同，但是从第二批发酵开始，发酵周期缩短至 60h。若采用连续发酵，则可以在高稀释的条件下连续稳定地产酶，这就更加提高设备利用率
23、。6）产品容易分离纯化：固定化细胞不溶于水，发酵完成后，容易与发酵液分离，而且发酵液中所含的游离细胞很少，这就有利于产品的分离纯化，从而提高产品的纯度和质量。7）适用于胞外酶等胞外产物的生产：由于固定化细胞与载体结合在一起，所以固定化细胞一般只是用于胞外酶等胞外产物的生产。5、固定化微生物原生质体发酵产酶有哪些特点？答：（1）变胞内产物为胞外产物：固定化原生质体由于解除了细胞壁的扩散障碍，可以使原本存在于细胞质中的胞内酶不断分泌到细胞外。变革了胞内酶的生产工艺。例如，笔者等人采用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶，使细胞内葡萄糖氧化酶的 90%以上分泌到细胞外。（2）提高酶产率：由于出去了细
24、胞壁，增加了细胞的通透性，有利于氧气和其他营养物质的传递与吸收，也有利于胞内物质的分泌，可以显著提高酶产率。例如，笔者等人的研究表明，固定化枯草杆菌原生质体发酵生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞间质中的碱性磷酸酶全部分泌到发酵液中，产酶率提高 30%。（3）稳定性好：固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可以反复使用或者连续使用较长时间，利于连续生产。（4）易于分离纯化：固定化原生质体易于和发酵液分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。6、试述酵发酵动力学的主要内容。答：发酵动力学的主要内容包括细胞生长动力学，产物生成动力学和基质消耗动力学。细胞生长动力学主要研
25、究发酵过程中细胞生长速率以及各种因素对细胞生长速率的影响规律；产物生成动力学主要研究发酵过程中产物生成速率以及各种因素对产物生成速率的影响规律；基质消耗动力学主要研究发酵过程中基质消耗速率以及各种因素对基质消耗速率的影响规律。六、综合分析题1、在酵发酵生产过程中，为了提高酶的产率，可以采取哪些措施？答：在酶的发酵生产过程中，要使酶的产率提高，必须采取一系列的措施，主要的有：（1）使用优良的产酶细胞：通过筛选、诱变、原生质体融合、基因重组、定向进化等手段，获得生长快、产率高、稳定性好的产酶细胞。（2）使用优良的发酵生产设备：通过精心设计或者选择使用高产、低耗的发酵罐等发酵生产设备。（3）采用先进
26、的分离纯化技术和设备：采用操作简便、收得率高的分离化技术设备，以达到高产丰收的效果。（4）控制好工艺条件：在发酵过程中，要根据菌种特性，确定培养基和发酵工艺条件，进行工艺优化，并根据需要和变化的情况及时加以调节控制。（5）此外还可以采取某些行之有效地措施，诸如添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂 等。2、从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。实验方法：将大肠杆菌细胞接种于营养汤肉培养中，于 37振荡培养，当 OD550 达到 0.3 左右时，将培养液分装到 4 个小三角瓶中，每瓶 17mL 培养液。于 4 个三个瓶中分别添加（A）3mL 无菌水；（B）1mL 乳糖溶液（0.1mo
27、l/L）和 2mL 无菌水；（C）1mL 乳糖溶液（0.1mol/L） 、1mL 葡萄糖溶液（0.1mol/L）和 1mL 无菌水；（D）1mL 乳糖溶液（0.1mol/L） 、1mL 葡萄糖溶液（0.1mol/L）和 1mLcAMP钠盐溶液（0.1nmol/L） 。然后在相同的条件下于于 37振荡培养 2h，分别取样测定 B-半乳糖腺酶的活力。实验结果：（A）瓶和（C）瓶样品的 B-半乳糖腺酶活力为 0， （B）瓶和（D）瓶样品的 B-半乳糖腺酶活力达到 1000U/mL 左右。答：从实验方法和结果可以进行下列分析，并得出如下结论：（1） （A）号瓶为对照，只加入无菌水，结果没有半乳糖苷酶产
28、生，表明半乳糖苷酶不是组成酶，而是诱导酶。（2） （B）号瓶加入半乳糖，结果在 2h 内半乳糖苷酶大量合成，表明乳糖是半乳糖苷酶的诱导剂。6（3） （C）号瓶与（B）号瓶相比，在含有乳糖的基础上增加了葡萄糖，结果也没有半乳糖苷酶产生，表明半乳糖苷酶的合成受到葡萄糖的阻遏作用，由于葡萄糖是一种容易利用的碳源，其对半乳糖苷酶的阻遏作用属于分解代谢物阻遏作用。（4） （D）号瓶与（C）号瓶相比，增加了 cAMP 结果半乳糖苷酶又大量合成，表明 cAMP 可以使分解代谢物阻遏作用解除。第三章 动植物细胞培养产酶一、名词解释1、动物细胞培养产酶2、植物细胞培养产酶3、端粒酶4、抗体酶5、半抗原6、超氧化
29、物歧化酶7、纤维酶原激活剂二、填空题1、植物细胞培养主要用于生产色素、香精、 药物、酶 、等次级代谢产物。2、动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子、酶等 功能性蛋白质 。3、抗体酶的主要获得方法有修饰法、半抗原诱导法 、酶蛋白抗原诱导法。4、植物细胞和微生物细胞的特性差异主要有细胞体积大，生长倍增时间长，营养要求较简单，大多数需要光照，对剪切力敏感 等显著特点。5、动物细胞培养方法主要有悬浮培养，贴壁培养、固定化细胞培养 。三、选择题1、半抗原（ B ）A、可以诱导抗体生成，但不能与抗体特异结合 B、可以与抗体特异结合，但不能诱导抗体生成C、可以诱导抗体产生，也可以与抗原特
30、异结合 D、不能与抗体特异结合，也不能与抗体特异结合2、端粒酶是（ CA、催化端粒水解的酶 B、存在于端粒中的酶 C、催化端粒生成和延长的酶 D、催化 RNA 生成和延长的酶3、抗体酶是（B）A、具有催化活性的抗体分子 B、具有催化活性的 RNA 分子 C、催化抗体水解的酶 D、催化抗体生成的酶4、纤溶酶原激活剂是（D）A 催化纤溶酶水解反应的酶 B 催化纤维蛋白水解反应酶 C 催化纤维蛋白原水解反应酶 D 催化纤溶酶原水解反应的酶四、简答题与计算题1、什么是端粒酶？简述其催化过程。答：端粒酶（Telomerase）是催化端粒合成和延长的酶。端粒酶的催化过程主要包括下列 3 个步骤：（1）结合
31、：端粒酶分子的 RNA 重复序列与 DNA 端粒末端按照互补原则结合。（2）延伸：以端粒酶分子的 RNA 为模板，通过反转录作用，使 DNA 分子上的端粒延伸。（3）移位：端粒酶移动到延伸后的端粒末端。重复上述过程，反复进行，使端粒不断延。2、何谓抗体酶？试述获得抗体酶的主要方法。抗体酶（abzyme）又称为催化性抗体（catalytic antibody）,是一类具有生物催化功能的抗体分子。抗体酶的制备方法主要有诱导法，修饰法等。修饰法是对抗体进行分子修饰，在抗体与抗原的结合部位引进催化基因，而成为抗体酶的方法。诱导法是利用特定的抗原诱导抗体酶合成的方法，根据所采用的抗原不同，诱导法有半抗原
32、诱导法和酶蛋白抗原诱导法。半抗原诱导法是以预先设计的过渡态类似物作为半抗原，与载体蛋白（如牛血清蛋白等）偶联制成抗原，然后免疫动物，再经过单克隆抗体制备技术制备、分离、筛选得到所需的抗体酶。酶蛋白抗原诱导抗体酶的生成是以某种外源酶蛋白作为抗原诱导抗体酶产生的方法。首先选定一种酶蛋白作为抗原免疫动物，在酶蛋白抗原的诱导下，动物体内产生与酶分子特异结合的抗体，再将获得的酶抗体免疫动物，并采用单克隆抗体技术制备得到与酶抗体特异结合的抗抗体。那么，抗抗体结合部位的构象与用作抗原的酶分子的结合中心的构象相同，对抗抗体进行筛选，就有可能获得具有催化活性的抗体酶。73、植物细胞培养有何特点？答：植物细胞培养
33、具有如下显著特点：（1）提高产率：使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物，可以明显提高天然产物的产率，例如，日本三井石油化学工业公司于 1983 年在世界上首次成功地采用紫草细胞培养 23 天。细胞中紫草宁的含量达到细胞干重的 14%，比紫草根中紫草宁的含量高 10 倍，植物细胞培养生产紫草宁的比产率达到5.7mg/d*g 细胞，比种植紫草宁比产率（0.0068mg/d*g 植物）高 830 倍。（2）缩短周期：植物细胞声场的倍增时间一般为 1260h，一般生产周期 1530d，这比起微生物来时相当长的时间，但是与完整植物的生长周期比较，却是大大地缩短生产周期。一般植物从发芽、生长到收获，短则
34、几个月，长则数年甚至更长时间。例如，木瓜的生长周期一般为 8 个月，紫草为 5 年，野山参则更长。（3）易于管理，减轻劳动强度：植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产，不受地理环境和气候条件等的影响，易于操作管理，大大减轻劳动强度，改善劳动条件。（4）提高产品质量：植物细胞培养的主要产物的产率较高，杂质较少，在严格控制条件的生物反应器中生产，可以减少环境中的有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀，产物易于分离纯化，从而使产品质量提高。（5）植物细胞对剪切力敏感 。（6）植物细胞培养需要一定的光照。4、举例说明植物细胞培养产酶的工艺流程。答：植物细胞培养产酶的工艺过程一般包括愈伤组织的诱
35、导，细胞悬浮培养和酶的分离纯化三个阶级，现以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例，说明其工艺过程。（1）愈伤组织的诱导：选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，在 4冰箱中放置 3 周，以打破休眠。去除外皮，先用 70%乙醇消毒 20 秒，再用 0.1%氯化汞消毒 10min，成 0.5cm3 左右的小块，植入含有3mg/L2,4-D 和 1.2mg/L 6-BA 的半固体 MS 培养基中，25、600lux12h/d 光照的条件下培养 18d,诱导得到愈伤组织，每 18d 继代一次。（2）细胞悬浮培养：将上述在半固体 MS 培养基上培养 18d 的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L
36、2,4-D 和 1.2mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25、600lux、12h/d 的光照条件下振荡培养 1012d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后再无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有 3mg/L2，4-D 和 1.2mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，25、600lux、2h/d 光照的条件下培养 18d。（3）酶的分离纯化：细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎，用 pH7.8 的磷酸缓冲液提取、有机溶剂沉淀等，分离得到超氧化物歧化酶。5、试述植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制。答：在植物细胞培养产酶的工艺条件及其控制主要包括培
37、养基，温度，pH，溶解氧，光照等。（1）培养基：植物细胞培养的培养基与微生物培养基有较大的差别，其主要不同点在于：植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐，除了 P、S、N、K、Na、Ca、Mg 等大量元素以外，还需要Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I 等微量元素；植物细胞需要多种维生素和植物生长激素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等；植物细胞要求的氮源一般为无机氮源，即植物细胞可以同化硝酸盐和铵盐；植物细胞一般以蔗糖为碳源。（2）温度：植物细胞培养的温度一般控制在室温范围（25左右） 。温度高些，对植物细胞的生长有利，温度低些，则对次级代谢物的积累有利，但是通常不能低于 20，也
38、不要高于 35。有些植物细胞的最适生长温度和最适产酶温度有所不同，要在不同的阶段控制不同的温度。（3）pH：植物细胞的 pH 一般控制在微酸性范围，即 pH 56。培养基配置时，pH 一般控制在 5.55.8范围，在植物细胞培养过程中，一般 pH 变化不大。（4）溶解氧：植物细胞的生长和产酶需要吸收一定得溶解氧。溶解氧一般通过通风和搅拌来供给。适当的通风、搅拌还可以使植物细胞不至于凝集成较大的细胞团，以使细胞分散，分布均匀，有利于细胞的生长和新陈代谢。然而，由于植物细胞代谢较慢，需氧量不多，过量的氧反而会带来不良影响。假山植物细胞体积大、较脆弱、对剪切力敏感，所以通风和搅拌不能太强烈，以免破坏
39、细胞。这在植物细胞反应器的设计和实际操作中，都要予以充分注意。（5）光照：光照对植物细胞培养有重要影响，大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生长要求一定波长的光的照射，并对光照强度和光照时间有一定的要求，而有些植物次级代谢物的生物合成却受到光的抑制。例如，欧芹细胞在黑暗的条件下可以生长，但是只有在光照的条件下，才能形成类黄酮化合物；8植物细胞中萘醌的生物合成受到光的抑制等。笔者等人的研究表明，光质对于玫瑰茄细胞培养生产花青素有显著影响，其中蓝光（波长 420530nm）可以显著促进花青素的生物合成。因此在植物细胞培养过程中，应当根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种类不同，进行光照的调节控制
40、。尤其是在植物细胞的大规模培养过程中，如何满足植物细胞对光照的要求，是反应器设计和实际操作中要认真考虑并有待研究解决的问题。（6）前体的添加：前体是指出于目的代谢物代谢途径上游的物质。为了提高植物细胞培养生长次级代谢物的产量，在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种有效的措施。例如，在辣椒细胞培养生产辣椒胺的过程中，添加苯丙氨酸作为前体，可以全部转变为辣椒胺，添加香草酸和异癸酸作为前体，亦可以显著提高辣椒胺的产量。（7）刺激剂的应用：刺激剂可以促进植物细胞中的物质代谢朝着某些次级代谢物生成的方向进行，从而强化次级代谢物的生物合成，提高某些次级代谢物的产率。所以在植物细胞培养中添加适当的刺激剂即可
41、以显著提高某些次级代谢物的产量。常用的刺激剂有微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶。例如，Rolfs 等人用霉菌细胞壁碎片为刺激剂，使花生细胞中 L-苯丙氨酸氨基裂合酶的含量增加 4 倍，同时使二丙乙烯合酶的量提高 20 倍；Funk 等人采用酵母葡聚糖（酵母细胞壁的主要成分）作为刺激剂，可使细胞积累小蘖碱的量提高 4 倍；笔者等人在鼠尾草细胞悬浮培养中，添加 0.5U/mL 的果胶酶作为刺激剂，可使细胞中迷迭香酸的产量提高 62%。6、试述动物细胞培养的特点。答：（1）动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质的生产，如疫苗、激素、酶、单克隆抗体、多肽生长因子等。（2）动物细胞的生长较慢
42、，细胞倍增时间 15100h。（3）为了防止微生物污染，在培养过程中，需要添加抗生素。加进的抗生素药能够防治细菌的污染，又不影响动物细胞的生长。现在一般采用青霉素（50100U/mL）和链霉素（50100 U/mL）联合作用。也可以添加一定浓度的两性霉素（fungizone） 、制霉菌素（mycostatin）等。此外，为了防治支原体的污染，可以采用卡那霉素、金霉素、泰乐菌素等进行处理。（4）动物细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感，所以在培养过程中，必须严格控制温度、pH、渗透压、通风搅拌等条件，以免破坏细胞。（5）大多数动物细胞具有锚地依赖性，适宜采用贴壁培养；有部分细胞，例如来自血液、
43、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞和杂交瘤细胞等，可以采用悬浮培养。（6） 、动物细胞培养基成分较复杂，一般要添加血清或其它用品，产物的分离纯化过程较繁杂，成本较高，适用于高价值药物的生产。原代细胞继代培养 50 代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞。7、动物细胞培养过程中要注意控制哪些工艺条件？答：在动物细胞培养中，要掌握好培养基，温度，pH，渗透压，溶解氧等各种工艺条件并根据具体情况进行适当的控制。（1） 、培养基动物细胞培养基的组分较为复杂，包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等。动物细胞培养液的组分复杂，有些组分的含量很低。所以应首先配制各类母液，如 100 倍浓度氨基酸母液，10
44、00 倍浓度维生素母液，100 浓度葡萄糖母液（溶解于平衡盐溶液）等；在使用前，分别吸取一定体积的母液，混匀得到混合母液，膜过滤除菌后，冷冻备用；使用时，取一定体积的混合母液，用无菌的平衡盐溶液稀释至所需浓度。（2） 、温度的控制温度对动物细胞的生长和代谢有密切关系。一般控制在 36.5，允许温度波动范围在 0.25之内。温度的高低也会影响培养基的 pH，因为在温度降低时，可以增加 CO2 的溶解度，而使 Ph 降低。（3） 、pH 的控制培养基的 pH 对动物细胞的生长和新陈代谢有显著影响。一般控制在 pH7.07.6 的微碱性范围内，通常动物细胞在 pH7.4 的条件下生长最好。在动物细胞
45、培养基过程中，随着新陈代谢的进行，培养液的 pH 将发生变化。从而影响动物细胞的正常生长和代谢。为此，在培养过程中需要对培养基的 pH 进行检测和调节。培养基中 pH 的调节，通常采用 CO2 和 NaHCO3 溶液。增加 CO2 的浓度，可使培养液的 pH 降低；添加碳酸氢钠溶液，可使 pH 升高。然后，通过改变 CO2 的浓度的方法来调节 pH，会对培养液中的溶解氧产生影响。所以在 pH 控制系统的设计和操作过程中，应当同时考虑溶解氧控制。在细胞密度高时，由于产生9的 CO2 和乳酸等物质的量增加，pH 的变化较大，需要时可以采用流加酸液或局部 pH 的较大波动和渗透压的增加，会对细胞生长
46、带来不利的影响。为了避免培养过程中 pH 的快速变化，维持 pH 的稳定，通常在培养液中加入缓冲系统。例如，CO2和 NaHCO3 系统，柠檬酸与柠檬酸盐系统等。此外，另一个被广泛采用的缓冲系统是羟乙基呱嗪乙磺酸（HEPES） 。HEPES 的添加浓度一般为 25mmol/L，则可能对某些细胞产生毒害作用。检测动物细胞培养液中 pH 的变化，常用的指示剂为酚红。可以根据酚红颜色的变化确定 pH。蓝红色为 pH7.6，红色为 pH7.4，橙色为 pH7.0，黄色为 pH6.5。(4）渗透压的控制动物细胞培养液中渗透压应当与细胞内的渗透压出于等渗状态。一般控制在 700850kPa 范围内。在配制
47、培养液或者改变培养基成分时，要特别注意。（5）溶解氧的控制溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要。供氧不足时，细胞生长受到抑制，氧气过量时，也会对细胞产生毒害。8、举例说明动物细胞培养产酶的工艺流程。答：现以人黑色素瘤细胞培养产生组织纤维酶原活化剂为例。说明动物细胞培养产酶的工艺过程及其控制。人黑色素瘤细胞培养采用 Eagle 培养基其工艺过程如下：（1） 、将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理，分散，用 pH7.4 的磷酸缓冲液洗涤，计数，稀释成细胞悬浮液；（2） 、在消毒好的反应器中装进一定量的培养液，将上述细胞悬浮液接种至反应器中，接种浓度为（13）*1000 个细胞mL，于 37的 C
48、O2 培养箱中，通入含 5% CO2 的无菌空气，培养至长成单层致密细胞；（3） 、倾去培养液，用 pH7.4 的磷酸缓冲液洗涤细胞 23 次；（4） 、换入一定量的无血清 Eagle 培养液，继续培养；（5） 、每隔 34d，取出培养液进行 tPA 的分离纯化；（6） 、然后再向反应器中加入新鲜的无血清 Eagle 培养液，继续培养，以获得大量 tPA；（7） 、从上述获得的培养液中采用亲和层析等技术进行分离纯化，获得组织纤溶酶原活化剂。第四章 酶的提取与分离纯化一、名词解释1、细胞破碎2、酶的提取3、沉淀分离4、层析分离5、凝胶层析6、亲和层析7、离心分离二、填空题1、细胞破碎的主要方法有
49、机械破碎，物理破碎，-化学破碎法，酶促破碎法 。2、酶的提取方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取， 有机溶剂提取 。3、结晶的方法主要有 盐析结晶法 ，有机溶剂结晶法，透析平衡结晶法，等电点结晶法。4、离心方法主要有差速离心，密度低度离心，等密梯度离心 。5、加压膜分离可以分为微滤，超滤 ，反渗透。6、常用的萃取方法有有机溶剂萃取，双水相萃取，超临界萃取，反胶束萃取。7、按照凝胶的组成系统不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分为连续凝胶电泳，不连续凝胶电泳，浓度梯度凝胶电泳，SDS 凝胶电泳 。8、在 CO2 超临界萃取中，目标产物的分离方法主要有等压分离，等温分离，吸附分离。三、选择题1、酶的提取是（D ）的技术过程。A、从含酶物料中分离获得所需酶 B、从含酶溶液中分离获得所需酶C、使胞内酶从含酶物料中充分溶解到溶剂或者溶液中 D、使酶从含酶物料中充分溶解到溶剂或者溶液中8、电
