1、新型佐剂研究及其应用概况,一、概论,凡是可以增强抗原特异性免答的物质均称为佐剂。,1、佐剂的定义,(adjuvant）一词来源于拉丁语，原为辅助之意。在免疫学和生物制品学上又称为免疫佐剂（immunologic adjuvant）。传统的概念为：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用者，都称之为佐剂。,2、作用特点,能明显增强多糖或多肽等抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答； 用最少量的抗原和最少的接种次数刺激机体可产生足够的免疫应答和高滴度的抗体，在血流或粘膜表面能维持较长的时间，发挥持久的效果。,3、佐剂
2、的作用,改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原；改变抗原的构型，使抗原物质降解并加强其免疫原性；延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，T细胞与B细胞）。,4、作用机理,抗原递呈（antigen presentation） 指抗原分子递呈给T细胞的方法。抗原递呈的方法对免疫应答的实质和强度有重要影响。佐剂与疫苗的联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。,抗原寻的（antigen targeting）,指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。佐剂对于抗原寻的涉及到的一系列机制
3、，包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等有重要作用。,免疫调节（immune modulation）,是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度。T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。,二、佐剂分类,按佐剂物理性质，分为颗粒型佐剂和非颗粒型佐剂；按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法），可分为微生物及其组分与非微生物物质；按佐剂在体内存留的时间，则可分为贮存型佐剂（depot type ad
4、juvant）和非贮存型（non-depot type adjuvant）。颗粒型佐剂多半属于贮存型的，非颗粒型佐剂大多属于非贮存型佐剂。,（一）颗粒性佐剂,1盐类佐剂：包括氢氧化铝胶、各种明矾、磷酸铝等。2油水乳剂佐剂 ：如弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant, FCA）、弗氏不完全佐剂（Freunds incomplete adjuvant, FIA）和矿物油白油佐剂。3免疫刺激复合物（ISCOM）佐剂。,颗粒性佐剂,4蜂胶佐剂（propolis）。5脂质体佐剂（liposomes）。6其他：MF59佐剂、微囊化佐剂（microencapsulation）、硬脂
5、酰酪氨酸佐剂（slearyltyrosine）和菊粉（gamma-inulin）等。,（二）非颗粒性佐剂,1肽类佐剂（peptides）：如胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、去胞壁酰多肽（desmuramyl peptides）、脂肽（lipopeptides）和免疫调节多肽（immunomodulatory peptides）等。2表面活性分子类佐剂（surface-active molecules）：如非离子阻断共聚物表面活性剂（nonionic block copolymers）和海藻糖合成衍生物（TDM）等。,非颗粒性佐剂,3核酸及其衍生物类佐剂（nucleic acid derivat
6、ives）：如合成核苷酸聚合体（synthetic olynucleotides）、次黄嘌呤衍生物（hypoxanthine derivatives）和免疫刺激序列DNA（CpG DNA或CpG 寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）等。,非颗粒性佐剂,4含硫复合物类佐剂（suiphur-containing compounds）：如左旋咪唑（levamisole）。5碳水化合物高分子类佐剂（carbohydrate polymers）：如香菇多糖（lentinan）、硫酸多糖（sulfated polysaccharides）等其他一些多糖和DEAE-葡聚糖等。6细胞因子类佐剂（cytokine）
7、：如白介素-1（IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）和-干扰素（-IFN）等。,非颗粒性佐剂,7脂质分子类佐剂（lipid molecules）：如脂多糖及其衍生物（lipopolysaccharide derivatives），一些脂溶性维生素（fat-soluble vitamins）如维生素A和维生素E等。8其他：包括一些蛋白毒素如霍乱毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维生素B12等。,常规佐剂和新型免疫佐剂,目前，铝盐类佐剂、油水乳剂佐剂和蜂胶佐剂等比较常用，属于常规佐剂。细胞因子类佐剂、 CpG DNA、基因工程减毒素
8、、免疫刺激复合物佐剂、脂质体佐剂及MF59佐剂等是目前研究的热点，其中有些也已经开始用于生产实际，属于新型免疫佐剂。,三、常规免疫佐剂,（一）铝盐类佐剂该类佐剂在生物制品上应用广泛，对体液免疫作用很明显，与抗原混合注射时，可通过抗原寻的过程显著增高抗体滴度。可溶性抗原与此类佐剂混合后成为凝胶状态，可建立一个短时的贮存颗粒，将可溶性抗原转化为一种便于吞噬的形式，以利于巨噬细胞吸附。,1氢氧化铝胶,又称铝胶，其佐剂活性与质量密切相关，质优的铝胶分子细腻、胶体性良好、稳定，吸附力强，保存两年后其吸附力不变。铝胶可用于制造多种兽用疫苗。各厂家采用不同的合成方法制备铝胶，优点各异。,制法,（1）用铝粉加
9、烧碱合成法：用量按下列反应式计算： 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4Al2(SO4)318H2OA12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明矾加碳酸钠合成法：用量按下列反应式计算：2 KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O2Al(OH)3+3Na2SO4+3CO2。（3）用三氯化铝与氢氧化钠合成：A1C13+3NaOHAl(OH)3+3NaCl。此法合成的铝胶含量低，透明无沉淀，目前广泛用于制备人用生物制品，认为佐剂效果良好，注射部位无硬结反应。,配制时注意事项：,氢氧化铝具有较强的吸附力，所以，制胶过程中一般用软化水或去离子水
10、洗涤。氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要掌握好化合时的pH值。贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，并严密封盖，贮放期不超过3个月。铝胶室温保存，以免破坏胶态。,2明矾（Alum）,有钾明矾（KAl（SO4）212H2O）和铵明矾（AlNH2（SO4）212H2O）两种。作为佐剂用于生物制品的主要是钾明矾（即硫酸铝钾）。制造时，先将灭活菌液调至pH 8.0土0.1，选精制明矾制成10溶液，高压灭菌后，冷至25以下备用。按菌液量加入明矾溶液12，充分振荡，然后沉淀。佐剂作用与氢氧化铝胶近似，但该法较简便，应用较广，如破伤风明矾沉淀类毒素和气肿疽明矾灭活疫苗等。在美国只有明矾可在人
11、体中应用。,3磷酸三钙,在疫苗中加入氯化钙和磷酸氢二钠，使在疫苗中化合成磷酸三钙，吸附抗原后沉淀，所制出的几种疫苗免疫效果良好。此法简便，质量稳定。铝盐类佐剂成本低廉，使用方便，安全性较好，已被广泛用于兽用疫苗，乙肝、白喉等重组疫苗的佐剂。,缺点：,轻度局部反应，可形成肉芽肿，个别形成局部无菌性脓肿；铝胶疫苗怕冻，冻后铝胶易变性；有可能对人、畜神经系统有影响；主要激活Th2免疫细胞，诱导体液免疫应答。而诱导细胞介导的免疫应答作用不明显。只适用于以抗体为主要保护性免疫的疾病的疫苗，如白喉、破伤风、乙肝、麻疹等。,（二）油乳佐剂,指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂，如弗氏佐剂。该类佐
12、剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等有关。一种好的乳剂疫苗应是油包水（水/油或W/O）或水包油（油/水或O/W）型，粘度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。,1乳剂的概念,“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒，混悬于另一不相溶的液体中所成的分散体系。被分散的物质称为分散相（内相），承受分散相的液体称连续相（外相），两相间的界面活性物质称为乳化剂。当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相时，制成的乳剂为W/O型，反之为O/W型。,W/O型、O/W型乳
13、剂比较,制成什么样的乳剂型，与乳化剂及乳化方法密切相关。通常W/O型乳剂较粘稠，在机体内不易分散，佐剂活性较好，为生物制品所采用的主要剂型；O/W型乳剂较稀薄，注入机体后易于分散，但其佐剂活性很低，生物制品一般不采用这种剂型。,2乳化剂,（1）乳化剂的种类天然乳化剂：来自动植物，如阿拉伯胶、海藻酸钠、蛋黄以及炼乳等。人工合成乳化剂，再分为离子型和非离子型。,离子型乳化剂,阴离子型：如碱肥皂、月桂酸钠、十二烷基磺酸钠和硬脂酸铝等，多用于乳化一般生物制剂；阳离子型：阳离子类乳化剂有氯化苯甲烃铵、溴化十六烷三甲基和氯化十六烷铵代吡啶等，用于制备一般的水包油生物制剂。,非离子型乳化剂,多数是多元醇或聚
14、合多元醇的脂肪酸脂类或醚类物质，如月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和单油酸脂等。它们具有一定的亲水性和亲油性基团，为制造医药或化妆品的乳化剂。制备注射用油乳剂灭活疫苗，最适用的乳化剂有去水山梨醇单油酸酯（其中，司本-80和Arlacel-A是同类产品）、聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯（商品名吐温-80）和硬脂酸铝等。,（2）乳化剂的选择,通常可根据用途，依据乳化剂的HLB值（亲水亲油平衡值）进行选择。乳化剂的HLB值与其在水中的溶解度相关；亲油性的在水中溶解度小，HLB值低，易形成油包水型油乳剂。HLB值为46的乳化剂适用于制造W/O型油乳剂；常用的司本-80，HLB值为4.3，在水中溶解度低，不易在水中
15、分散，溶于多种有机溶剂，性质稳定，易形成W/O型油乳剂；亲水性强的在水中溶解度大，HLB值高，容易形成水包油型油乳剂； HLB值在818的乳化剂适用于O/W型油乳剂。吐温-80，其HLB值为15.0，易溶于水，易形成O/W型油乳剂。,3白油佐剂,制苗用的白油应无多环芳烃化合物、粘度低、无色、无味和无毒性。Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4是国内外常用的制苗用白油。我国目前选用杭州炼油厂的7号或10号白油和北京石油化工科学研究院的合成白油，其质量标准为：无色无味，50运动粘度7m2s左右，紫外吸收值（250350nm）0.1，紫外消光系数12108；单环芳烃与双环芳
16、烃含量低于0.5，无多环芳烃；小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，观察60d，表现正常。,4乳剂配方与乳化方法,使用不同乳化剂和不同的配合比例及乳化方法，决定了制备乳剂的性状和稳定性。疫苗生产中主要有两种基本方法。（1）剂在水中法：此法将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。,（2）剂在油中法：,此法将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5m左右，
17、比较稳定。,免疫实验动物用的佐剂,其配方按容量计为：矿物油（白油）75%85， 乳化剂1525%，混合后经除菌过滤而成为弗氏不完全佐剂（FIA）；如向其中加入0.5mgm1死结核杆菌即为弗氏完全佐剂（FCA）。 使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。 也可用9份油和1份司本-80混合后加2吐温-80和12%硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，注射前将配好的油佐剂与抗原水相1：1混合，强力振摇，可配制成性状良好的乳剂疫苗。,副作用,弗氏佐剂具有高度佐剂活性，因而应用广泛。但因副作用强烈而限制其应用。很少用于动物免疫。油通过肌膜层造成组织损伤，局部形成结节和无菌性脓肿
18、。加入了结核菌素，能使PPD试验阳性。可能致癌；过于粘稠，难以注射。,大量生产,可将94白油与6司本-80混合后加1%2硬脂酸铝，灭菌后即为油相；将抗原液加24%吐温-80为水相。乳化时，将油相与水相按3：12：1比例配制，先缓速混合，再通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。双相乳剂疫苗：将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2吐温-80生理盐水，通过搅拌或胶体磨乳化，可制成双相乳剂疫苗（水-油-水乳剂或称多型乳剂Multiple emulsion adjuvant）。优点是：粘稠度低、在注射部位易分散、局部反应轻微及佐剂效应良好等。,5油乳剂检验,生产实际中以粘度测定和稳定性测定为主。 （1）
19、粘度测定：最简易的方法是取内口直径为1.2mm的吸管，在室温下吸满lml乳剂，垂直放出0.4ml所需时间作为粘度单位，以0.4ml 26S为合格，不得多于1015S，否则注射时就比较困难。也可用Saybolt粘度计。（2）乳剂稳定性测定：加速老化法：疫苗于37贮存1030d不破乳。离心加速分层法：在一个半径为10cm的离心器中装油乳剂，3 000rpm离心15min不分层，相当于保存1年以上不破乳。,（三）蜂胶佐剂,1蜂胶的理化特性与质量标准蜂胶（Propolis）是蜜蜂采自柳树、杨树、栗树和其它植物幼芽分泌的树脂，并混入蜜蜂上颚腺分泌物，以及蜂蜡、花粉及其它一些有机与无机物的一种天然物质，含
20、有多种黄酮类、酸类、醇类、酚类、脂类、烯烃和萜类等化合物及多种氨基酸、酶、多糖、脂肪酸、维生素及化学元素，是一种优良的天然药物。,3蜂胶的佐剂作用,蜂胶具有广泛的生物活性和药理作用。具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎、增强机体免疫功能和促进组织再生等作用。蜂胶具有良好的免疫增强作用。它能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。,4蜂胶佐剂疫苗制备方法,（1）蜂胶的处理：用市售蜂胶，放4以下低温贮存，用前在48下粉碎，过筛，按1：4（W/V）加95的乙醇，室温浸泡2448h，冷却，过滤或离心取上清，即得透明栗色纯净蜂胶浸液。除去干渣计算出浸液中含蜂胶量
21、，浸液4以下保存备用。,（2）蜂胶佐剂疫苗的制备,（以禽霍乱蜂胶疫苗为例）：将纯净培养的鸡多杀性巴氏杆菌液，经甲醛灭活后，加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂胶10mg，边加边摇荡，迅即成为乳浊状，即为蜂胶佐剂疫苗。,四、细胞因子类佐剂,1979年第2届国际淋巴因子会议命名第1个细胞因子白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）在机体免疫系统活动过程中，有许多种体液性免疫分子和细胞因子参与。前者如免疫球蛋白、补体和胸腺肽类。后者作为免疫活性细胞间相互作用的介质和强有力的蛋白性调节因子，可以调节免疫反应、炎性反应、组织修复、组织移植反应和造血。,（一）细胞因子的概念与分类,细胞因子（c
22、ytokine）是机体的各种细胞在其生命周期中所释放的具有不同生物学效应的物质，是免疫细胞间相互作用的调节信号。该类物质相互诱生，相互影响，构成一个巨大的细胞因子网络（cytokine network）系统，各种细胞借助自己所释放的细胞因子完成各自的功能，在免疫应答中发挥作用。,分类,一类为经典的细胞因子，包括淋巴毒素（LT）、肿瘤坏死因子（TNF）、和干扰素（INF）等； 另一类为对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子，其代表为白细胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF），可以促进和抑制免疫应答。 绝大多数的细胞因子的分子量小于25KD，分子量最低者如IL-8仅8KD。 多数细胞因子以单体形式
23、存在，少数以双体形式发挥生物学作用。,（二）细胞因子的作用特点,1多效性：免疫调节作用的多样性：如IL-6除参与B细胞的分化、增值调节、抗体形成外，还对骨髓造血干细胞定向分化起重要作用，引起炎症反应及较强的抗病毒活性；作用方式的非特异性：由特异性抗原或非特异性因子诱生的细胞因子，均以非特异性方式起作用，既不与抗原发生反应，也不表现抗原特异性。,细胞因子的作用特点,2靶细胞的多样性：细胞因子作用的靶细胞多种多样，包括单核-巨噬细胞、淋巴细胞、多型核白细胞、胸腺细胞、NK细胞、骨髓细胞和成纤维细胞等。该特征是构成机体复杂的细胞细胞调节网络的基础。3多源性： 表现为一种细胞因子可由多种不同来源的细胞
24、产生，如可产生IL-1的细胞有B细胞和NK细胞等免疫活性细胞及巨噬细胞、树突状细胞、郎罕氏细胞和星形细胞等抗原提呈细胞； 一种免疫细胞可以产生多种细胞因子。 T细胞可产生IFN-、TNF及IL等细胞因子。,细胞因子的作用特点,4高效性：细胞因子的作用方式与内分泌激素类似，有内分泌（endocrine）、旁分泌（paracrine）及自分泌（autocrine）等几种形式，因此又有免疫激素（immune hormone）之称。细胞因子在机体内的产量虽很低，但都表现极高的生物学活性，10-110-15M即可显示明显的生物学活性。5快速反应性：即对激发因素的迅速反应。细胞因子是一种分泌型蛋白质，当免
25、疫细胞受到刺激后，迅速在粗面内质网内合成，转移到高尔基体内糖基化，然后通过分泌颗粒不断排出细胞外。它在细胞内极少存储，一旦刺激终结，即停止合成，并迅速降解。,（三）细胞因子的应用,1作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果：有些疫苗特别是死苗和亚单位苗免疫效果往往不理想，而多种细胞因子可以调节免疫应答，是有效的免疫增强剂，可提高机体免疫应答能力，明显提高疫苗的免疫效果。但细胞因子佐剂活性一般不如常规佐剂。,2作为免疫治疗剂，预防和治疗某些病原感染,用细胞因子处理未感染动物，可以增强动物的免疫功能，起到免疫治疗的作用。如TNF、IL-1、IL-6和IL-8等细胞因子均参与机体的炎症反应过程；许多细胞因子
26、对外来致病微生物及对肿瘤细胞生长都有抑制作用，在临床上具有潜在的应用价值。,3通过基因重组，构建新型基因工程疫苗：,将细胞因子基因插入一些基因缺失疫苗或活载体内，并使之表达，可以克服一些疫苗在特定状态下的安全问题，从而获得理想的疫苗。如把小鼠或人IL-2的cDNA与含禽流感血凝素（HA）基因的痘病毒重组，获得可以表达IL-2的重组痘病毒。裸鼠免疫试验结果显示，IL-2的插入并不影响HA的表达水平及免疫原性，并且可以防止禽流感病毒对裸鼠的致死，说明插入细胞因子可以大大提高活病毒载体的安全性。,（四）几种重要的细胞因子,1白细胞介素-1（IL-1）：又称淋巴细胞活化因子，是由抗原-抗体复合物、Co
27、nA、PPD、LPS及MDP等诱导巨噬细胞、单核细胞和其它多种组织细胞活化后分泌产生的一类激素样多肽。分子量1520kDa，在pH值412之间稳定，601h作用不被破坏，可被蛋白分解酶处理而失活，可抵抗神经氨糖酸苷酶处理。,IL-1是细胞因子网络中的关键因子,可作用于多种免疫活性细胞，并扩大其功能，在抗感染免疫、抑制肿瘤细胞生长（抗肿瘤免疫）及维持机体内环境的平衡（免疫自稳）中起着重要作用。目前，多种动物的IL-1 cDNA已被克隆，如猪、牛和羊等，也已获得重组IL-1；人的IL-1已工业化生产，正在进行临床治疗试验，主要用作免疫增强剂。在动物医学上，IL-1主要用作免疫佐剂，可提高抗体滴度，
28、但它也有明显的副作用，主要表现为发热和拉稀等。,2白细胞介素-2（IL-2）：,是T细胞在抗原或促有丝分裂原（如ConA）刺激下所分泌的一种淋巴因子，可引起T细胞增殖和维持T细胞在体外的持续生长，故曾称为T细胞生长因子（TCGF）。IL-2是一种糖蛋白，含133个氨基酸；分子量为1535kDa，于7030min及pH值29范围内稳定，无抗原特异性。具有促进T细胞生长、诱导或增强细胞毒性细胞的杀伤活性、协同刺激B细胞增值及分泌免疫球蛋白、增强活化的T细胞产生IFN和CSF、诱导淋巴细胞表达IL-2R、促进少突胶质细胞的成熟和增殖及增强吞噬细胞的吞噬杀伤能力等免疫生物学效应。,作用于多种免疫细胞，
29、包括T、B淋巴细胞，巨噬细胞和NK细胞等，对免疫应答有广泛的上调作用。IL-2是人和兽药研究中研究最多的细胞因子，除作用于外周T细胞增殖及抑制T细胞凋亡外，可能具有刺激胸腺产生T细胞的作用，从而为免疫重建起作用。,3白细胞介素-4（IL-4）：,又称为B细胞刺激因子（BSF-1），是由Th细胞经抗原或丝裂原刺激后产生的一类重要的淋巴因子。为蛋白性质的肽类，分子量1520kDa，有23个糖基化部位，由140个氨基酸构成。IL-4对多种细胞均有作用，是细胞因子网络中的重要组成部分。IL-4主要刺激B细胞的分化增殖，它能上调MHC类抗原、人白细胞功能相关抗原-的表达，在体外，可增加CTL细胞毒作用和
30、刺激TIL的溶解和扩增。对T、B淋巴细胞分化和成熟具有潜在的佐剂活性。它能激活T细胞、B细胞、NK细胞和自身受体IL-4R，增强或抑制免疫球蛋白的合成，可能成为一种强有力的佐剂候选因子。,4白细胞介素-6（IL-6）：,是细胞因子网络中的关键成分，除影响B细胞和T细胞的增生与分化外，还参与CTL分化及对颗粒细胞和巨噬细胞的作用。,5白细胞介素-12（IL-12）：,是目前发现的唯一主要由B细胞产生的细胞因子，与IL-2有协同作用，所以曾被称为细胞毒淋巴细胞成熟因子（CLMF）和天然杀伤细胞刺激因子（NKSF）。IL-12为糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）两
31、个亚单位构成，两个亚单位完全由不同的基因所编码，只有结合为一个完整的分子时才能发挥生物学活性。IL-12与亚剂量的IL-2能协同诱导抗体产生细胞毒T淋巴细胞（CTL）。,白细胞介素-12（IL-12）：,IL-12还能诱导NK细胞和T细胞产生IFN-。IL-12活性高于IL-2和IFN，在极低浓度时（1-30ppm）就有显著活性，对灭活疫苗、肿瘤和寄生虫抗原具有有效的佐剂活性。IL-12诱导产生的Th1应答反应尤为引人注目，是最强的NK细胞激活因子，也是迄今为止诱导Th1型免疫应答最主要的细胞因子。在Th1免疫反应的起始和抗原特异性CTL激活过程中起关键作用。可望用于主要诱导细胞免疫应答的疫苗
32、佐剂。,6白细胞介素-18（IL-18）：,也称为IFN-诱导因子，是新近发现的鼠和人的细胞因子，可强烈诱导Th1细胞因子的产生，激活NK细胞，高效分泌IFN2，刺激T细胞增殖和增强CTL的活性，与IL-12产生协同作用等。,7-干扰素（interferons-，IFN-）,是由致敏T细胞（Th1细胞和NK细胞等）在活的或灭活的病毒等干扰素诱生剂和某些细胞因子作用下所产生的一类高活性多功能的糖蛋白，分子量2025kDa，由144个氨基酸组成，等电点8.6。它的分子量小，可以自由出入细胞，作用无特异性。 具有抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞分裂、免疫调节和免疫佐剂等多种免疫生物学活性。具有广谱的抗病毒作
33、用，使病毒增殖量减少，细胞损伤程度降低，其作用是抑制病毒的复制。还能增强T细胞、B细胞、NK细胞的活性.,作用,它促使宿主细胞阻止病毒生长，细胞产生一种抗病毒的物质 再阻止宿主细胞为病毒译制病毒蛋白质 阻止病毒增殖。IFN-的佐剂作用主要是诱导MHC-的表达。当IFN-与抗原在同一位置同时使用时，佐剂效果最好。,应用,目前，我国已开发研制成功猪白细胞干扰素（swine interferon）。该制品系用鸡新城疫病毒诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装等工艺制成。用于防治猪流行性腹泻，每头每日肌肉注射一次，乳猪10，000单位，仔猪20，000单位；病重者每天可注射两次，连续35d为一
34、个疗程。,猪用干扰素：,主要用于TGE、PED、RV感染，口蹄疫，猪瘟、兰耳病、园环病毒感染，PR、SI，水疱病，细小病毒等防治，特别是与猪用转移因子协同应用，效果更佳。每40公斤体重肌肉注射1毫升，每日1次，连用3天。重症加量2-3倍。与猪用转移因子联合应用，用灭菌用水或生理盐水稀释，分别肌注。,使用注意点及使用法：,1、在使用后96小时内不要接种弱毒苗，可以同时使用灭活苗，但不要混合注射。2、用灭菌用水或生理盐水稀释，不能用酸碱性溶液或葡萄糖盐水稀释。3、妊娠母猪、哺乳母猪及仔猪使用安全。4、启用后在规定时间内一次用完，解冻溶化后不要再进行冰冻，在4可存放3天。,应用注意点,5治疗病毒性腹
35、泻，同时肌注复方穿心连或双黄连或痢菌净或氟哌酸等止泻消炎的药，每日1-2次，连用4天。并改饮电解质多维或口服补液盐7天。6口蹄疫：配合转移因子注射。同时配合肌注复方灵芝多糖注射液或复方黄芪多糖注射液，并与防止心肌炎的药物，如天王大败毒注射液或五毒康注射液联合应用。每日1-2次，连用3天。,7其它病毒感染：,同时配合肌注复方灵芝多糖注射液或复方黄芪多糖注射液或复方柴胡注射液等抗病毒的药物，每公斤体重肌肉注射0.1毫升，每日1次，连用3-4天。要配合使用广谱抗生素,如头孢噻呋,替米考星,氟苯尼考,强力霉素、阿莫西林、磺胺类药物。注射或饲料加药。为增强疗效，配合转移因子，每100公斤体重肌肉注射1毫
36、升，每日1次，连用3天。,二、CpG DNA,CpG DNA是含有非甲基化CpG（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序的脱氧核糖核酸DNA。CpG基序（CpG motif）是具有较强免疫活性的以非甲基化的CpG为基元构成的回文序列，其碱基排列大多为5-Pur Pur- CG- Pyr Pyr-3，也称为免疫刺激序列（ISS，immunostimulatory DNA sequences）。,CpG DNA,在动物体内能诱生强烈的免疫反应，在诱导机体非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答及调控免疫应答类型（Th1或Th2型）等方面发挥重要作用。激活NK细胞和巨噬细胞；刺激B淋巴细胞增殖、分化及产生免疫球
37、蛋白（immunoglobulin，Ig）；诱导分泌IL-6、IL-12、TNF-和IFN-等多种细胞因子；诱导抗抗体诱生的细胞凋亡。,（一）CpG DNA的免疫学活性,1对B淋巴细胞的作用 细菌DNA可直接激活B淋巴细胞产生免疫球蛋白，此过程为非T细胞依赖性和非抗原特异性。如大肠杆菌质粒DNA和CpG-ODN可在小鼠体内诱导B淋巴细胞分泌IL-6等细胞因子。2对巨噬细胞的作用 CpG DNA通常可直接激活巨噬细胞，并促进多种Th1类细胞因子的分泌，如IL-12、TNF-、IFN-和IFN-等。如细菌DNA和CpG-ODN均可诱导小鼠巨噬细胞产生TNF- mRNA。,CpG DNA的免疫学活性
38、,3对NK细胞的作用 CpG DNA不能直接活化NK细胞，但可通过辅助细胞刺激细胞因子（如IL-12、TNF-、IFN-/）的释放间接地作用于NK细胞。4对淋巴细胞的作用 CpG DNA不能直接活化T淋巴细胞，但能够在单核细胞和NK细胞分泌的细胞因子（如IFN-）作用下间接激活T淋巴细胞。,（二）CpG DNA的佐剂效应与应用前景,由于Th1免疫反应在微生物感染中具有重要作用，因而研究新型可诱导Th1免疫、安全、无副作用的佐剂，无论对兽用疫苗还是医用疫苗都至关重要。合成的CpG-ODN可诱导巨噬细胞分泌IL-12、NK细胞分泌IFN-。这些细胞因子能诱导Th1细胞分化，显示了CpG-ODN作为
39、佐剂的潜在价值。而且CpG-ODN与铝盐佐剂有协同刺激活性，既能诱导强的体液免疫，又能诱导细胞免疫和粘膜免疫反应。实验动物模型研究发现，CpG DNA对治疗病毒感染、哮喘、过敏性疾病及肿瘤均有良好的效果。,三、基因工程减毒素,基因工程减毒素是一类免疫佐剂的总称。细菌细胞壁成分或毒素不但能刺激机体产生免疫应答，而且在和抗原一起使用时，具有明显的佐剂效应。由于这些成分为细菌细胞壁成分或毒素，因而具有较强的毒性。该类毒素（尤其蛋白毒素）通过脱毒后，这些物质可以起到良好免疫佐剂的功效。目前，已证明经过基因突变体外表达的霍乱毒素（CT）、大肠杆菌不耐热毒素（LT）和破伤风类毒素（TT）等没有毒性，但具有
40、很好的佐剂作用。,（一）霍乱毒素（CT）,霍乱毒素(CT)是良好的粘膜免疫原。CT是由A和B两个区构成的蛋白。B区具有主要免疫学作用，内含5种独立的非共价连接的B亚单位（CTB），无毒性，可与细胞结合。A区是CT的生物学活性部分，具有酶活性。它能提高对多种口服天然抗原的局部粘膜免疫力。 CT作为粘膜免疫佐剂的主要缺点是其本身具有毒性，天然CT不能用于人类，但可以用于动物。用戊二醛将仙台病毒与CT结合，CT毒性降低1000倍，但仍有佐剂性质。,霍乱毒素（CT）,将CTB与流感病毒凝血素（HA）结合，免疫后发现，一个剂量的CTB-HA可产生高水平的IgA和IgG抗体，而两个剂量的HA不能诱导抗体产
41、生。而抗体水平与抵抗致死性攻毒有关。链球菌表面蛋白与CTB结合后，可诱导产生高水平的抗体。如不与CTB结合，要产生相同水平的抗体，则需100倍的抗原。CT毒素A和B两个亚单位的表达质粒DNA作为佐剂与DNA疫苗联合应用，还可诱导机体产生很强的Th1细胞因子反应（如IFN-）和Th2细胞因子反应（如IL-4），具有很强的佐剂作用。,大肠杆菌不耐热毒素（LT）,大肠杆菌LT毒素有A和B两个亚单位，有一定抗原性，但其毒性很强。通过基因工程点突变技术，使A亚单位上的一个氨基酸发生改变，表达的 则无毒性作用，但保留了其佐剂效应。该表达产物可诱导机体产生局部粘膜免疫反应。利用基因突变技术，构建的A和B两个
42、亚单位的表达质粒DNA联合应用，可诱导机体产生很强的Th1细胞因子反应（IFN-）和Th2细胞因子反应（IL-4）。而且，LT毒素表达质粒作为佐剂，可协助DNA疫苗诱导机体产生更强的细胞免疫反应，有望成为一种新型免疫增强剂。,破伤风类毒素（TT）,研究表明，TT也具有很强的佐剂效应，特别是适合于多糖或小分子肽半抗原免疫。这些抗原经偶联结合到TT后，可诱发机体产生高水平的IgG抗体应答。,四、其他新型免疫佐剂,（一）免疫刺激复合物（ISCOM）免疫刺激复合物（immunostimulating complex）是由抗原物质与由皂树皮提取的一种糖苷Quil A和胆固醇按1：1：1混合后自发形成的一
43、种具有较高免疫活性的脂质小泡。ISCOM直径40nm，每个ISCOM约含1012分子的蛋白质。ISCOM是一种全新的抗原递呈系统，对机体有免疫增强作用，具有佐剂和抗原递呈的两重功效。应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗，具有产生“全面”免疫应答的效力，可长期增强特异性抗体应答。另外，ISCOM能有效地通过粘膜给药，从而可以用于抗呼吸道感染。目前，兽用ISCOM疫苗已在国外投放市场。,1ISCOMs的制备,目前，已有20多种病毒的亲水脂蛋白(如外壳蛋白)以及若干种细菌和原生动物的膜蛋白被用于制备ISCOMs。制备时，首先用Triton、Tween、链烷基-N-甲基葡萄糖胺（MEGA）和葡萄糖辛酸
44、酯（OG）等中性去垢剂将微生物裂解成分散的组分，并在形成ISCOMs的同时除去去垢剂。其方法有离心法和透析法。,2ISCOM的作用机理,ISCOM是一种具有较高免疫学价值的新的抗原递呈系统，其对辅助性T细胞、细胞毒T细胞和B细胞都有活化作用,在抗原递呈、抗原寻的和免疫调节的过程中都有作用，增强APC活性。ISCOM可增强机体对大多数抗原的体液免疫和迟发型变态反应，调节MHC类抗原表达，刺激机体产生抗非感染性抗原的MHC类限制的CD8+细胞毒T细胞；,ISCOMs的作用机理,ISCOM作为吞噬性抗原，可直接通过MHC分子处理并提呈给T细胞，也可通过皂素与膜结构相互鳌合到达胞质。诱导特异性抗体及亚
45、型产生，增强CD8+CTL应答，提高MHC分子在抗原提呈细胞的表达，诱导IL-1，IL-2及-IFN分泌，具有黏膜免疫活性。可激发细胞介导的免疫反应，也可刺激体液免疫。还能克服母源抗体的封闭作用，通过黏膜途径提呈抗原。是目前诱导CTL反应最强的免疫刺激物。,（二）脂质体佐剂,脂质体（liposomes）是人工合成的具有单层或多层单位膜样结构的脂质小囊，由一个或多个类似细胞单位膜的类脂双分子包裹水相介质所组成，具有佐剂兼载体效应。其作用方式主要是在抗原寻的中起作用。脂质体的结构有利于将抗原递呈给抗原处理细胞或其它免疫活性细胞。吞噬细胞吞噬脂质体并破坏其膜结构，释放抗原并形成免疫复合物，有利于维持
46、长时期的高效价抗体及产生免疫记忆。脂质体在宿主体内可以生物降解，本身无毒性，并且能降低抗原的毒性，无局部注射反应。脂质体与弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用，效果更佳。目前，脂质体和ISCOM被认为是制备亚单位疫苗的理想载体和免疫佐剂。,（三）MF59佐剂,MF59佐剂由4.3的角鲨烷、0.5的吐温-80和0.5Span85组成。副反应轻微，是除铝盐外，目前仅有的被批准作为人用的免疫佐剂。在抗原中加入MF59佐剂的疫苗有很多种，如猿猴和人爱滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒和疟疾原虫抗原等，制成的疫苗常为OW型。MF59不但可以刺激体液免疫，还可以激发细胞免疫。已进行了广泛的实验，人数超
47、过8000，当和HAS-2合用的1/2期临床试验中，产生的抗体量与使用铝佐剂量相同，也同样有较强的辅助T细胞应答。,（四）生物降解微球（microsphere）,用微球囊括抗原的可控制释放系统，注射一针可以解决全程免疫问题。最成功和研究最多的抗原载体系统是聚脂类微球，可用于包裹激素、细胞因子、病毒颗粒及质粒DNA等活性物质。微球的内部结构：一种是贮存型（微囊），在聚合物形成的囊腔中包有抗原物质。二是实体型（微球）抗原均匀分布于聚合物内。这种效果更好，便于抗原释放的控制。抗原释放有两种方式：脉冲式和持续式。后一种方式 可在相当长的时间内持续释放抗原。,问题：,微球材料需要用有机金属催化剂，残留物
48、的副作用。微球制备时要用有机溶剂，也有残留问题；蛋白类等抗原物质，遇有机物会发生变性，聚集等反应。影响免疫效果。口服疫苗要消毒，所用的射线对抗原有损伤，对微球有降解作用。保存微球要冻干，但如何避免抗原不受影响？,（五）微生物,1、卡介苗：是巨噬细胞的激活剂，同时还能刺激骨髓的多功能干细胞发育成为免疫活性细胞，从而明显提高机体的免疫力。是一种非特异性免疫增强剂。2、短小棒状杆菌：经加热或甲醛灭活制成。对机体毒性低，没有严重的副作用。能非特异性刺激 淋巴样组织增生，加强单核巨噬细胞的吞噬能力，加速抗原处理，增加抗体IgG,、IgM的生成。,3.单磷腺脂A（monophosphoryl lipid A,MPL）,LPS 是来自革兰氏阴性菌的内毒素，其佐剂效应主要来自脂质A。但由于其自身具有较大的毒性而无法作为人类疫苗的佐剂从一株沙门氏菌的细胞壁酸水解，从LPS中纯化出脱毒的MPL产生的，是安全的免疫佐剂。能增强初次及再次免疫应答，提高机体的IFN2水平，增强Th1型细胞活性，抑制型Th2细胞活性，产生IgG2a抗体亚型的活性而且能引起脾DC 、MHC类分子和B7共刺激分子的上调，另外可强烈的迟发型变态反应和CTL活性。,
